色譜定量方法講稿第一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三內(nèi)容定量分析基礎(chǔ)定量方法影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性的因素色譜定量分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理第二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三定量分析基礎(chǔ)定量分析定義定量分析就是要確定樣品中某一組分的準(zhǔn)確含量。色譜定量分析是一種相對定量方法，是根據(jù)檢測器的響應(yīng)值與被測組分的量，在某些條件限定下成正比的關(guān)系來進(jìn)行定量分析的。第三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三色譜定量分析的基本公式Wi（ci）=fiAi（hi）Wi——組分的質(zhì)量；ci——組分的濃度；fi——組分的校正因子；Ai——組分的峰面積；hi——組分的峰高。想得到可靠的定量分析結(jié)果，需要準(zhǔn)確測定fi、Ai或hi第四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三峰面積和峰高峰面積——色譜峰與峰底（或基線）所圍成的面積；峰高——色譜峰峰尖至峰底（或基線）的距離；峰底——從峰的起點與峰的終點之間的一條連接直線；基線——在正常操作條件下，僅有流動相通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號曲線；一個完全分離的峰，峰底和基線是重合的。第五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三峰面積和峰高的測定使用積分儀和色譜工作站測量峰面積和峰高

儀器根據(jù)設(shè)定的積分參數(shù)（半峰寬、斜率、最小峰面積或峰高等）和基線的設(shè)定來計算每個色譜峰的峰面積和峰高使用記錄儀記錄色譜峰

需要手工測量的方法計算色譜峰的峰面積和峰高第六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三定量校正因子的測定絕對校正因子

前述公式中，fi為i組分的校正因子，其物理意義是單位峰面積（峰高）所代表的i組分的量，是一個與i組分的物理化學(xué)性質(zhì)和檢測器性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)；

對同一個檢測器，等量的不同物質(zhì)其響應(yīng)值是不同的，但對于同一種物質(zhì)其響應(yīng)值只與該物質(zhì)的量（或濃度）有關(guān)。第七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三絕對校正因子計算公式

fi=mi(ci)/Ai(hi)mi(ci)——i組分的質(zhì)量（濃度）；Ai(hi)——i組分的峰面積（峰高）。由上式計算出的校正因子稱為絕對校正因子，它只適用于這一個檢測器。第八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三相對校正因子相對校正因子(f)是某物質(zhì)(i)與基準(zhǔn)物質(zhì)(s)的絕對校正因子之比。計算公式

f=fi/fs=mi(ci)×As(hs)/[ms(cs)×Ai(hi)]常用的基準(zhǔn)物質(zhì)對不同檢測器是不同的

熱導(dǎo)檢測器——苯

氫火焰離子化檢測器——正庚烷第九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三定量方法色譜中常用的定量方法

歸一化法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法

內(nèi)標(biāo)法

標(biāo)準(zhǔn)加入法按測量參數(shù)分為峰面積法和峰高法

第十頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三峰面積法和峰高法的選擇如何選用主要決定于在檢測器的線性范圍內(nèi)，峰高和峰面積測量的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。在分離度較好，色譜峰形較好，峰面積可以準(zhǔn)確測量時，特別是氣相程序升溫和液相梯度洗脫時，適宜用峰面積法定量；反之，如分離不好、峰形不佳時，用峰高法定量較好。保留時間短峰形較尖的色譜峰，峰高法比峰面積法更準(zhǔn)確；保留時間長峰形較寬的色譜峰，峰面積法比峰高法更準(zhǔn)確。第十一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三歸一化法定義——把所有出峰的組分含量之和按100%計的定量方法。當(dāng)樣品中的所有組分均能流出色譜柱，并在檢測器上都能產(chǎn)生信號的樣品，可用歸一化法定量。計算公式第十二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三歸一化法優(yōu)點

簡便、準(zhǔn)確，特別是進(jìn)樣量不容易準(zhǔn)確控制時，進(jìn)樣量的變化對定量結(jié)果的影響很小。其它操作條件，如流速、柱溫等變化對定量結(jié)果的影響也很小。缺點

校正因子的測定較為麻煩主要用于GC的定量測定。第十三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三標(biāo)準(zhǔn)曲線法也稱為外標(biāo)法，是色譜定量分析中比較常用的方法。具體做法：

1、配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在規(guī)定的色譜條件下進(jìn)樣，測量色譜峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

2、在與繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線完全相同的色譜條件下進(jìn)行樣品的測定，測量色譜峰的峰面積或峰高，然后根據(jù)峰面積或峰高在工作曲線上查出樣品組分的濃度；

3、根據(jù)樣品處理條件，計算原樣品中組分的含量。第十四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三標(biāo)準(zhǔn)曲線法單點校正法——當(dāng)待測組分含量變化不大，且已知這一組分的大概含量時，也可不必繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，而是選取和待測組分會含量相近的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，與待測樣品溶液在相同色譜條件下分別進(jìn)樣，測量待測組分和標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積或峰高，由下式計算樣品溶液中待測組分的含量。單點校正法實際上是利用原點作為標(biāo)準(zhǔn)曲線上的另一點。因此，當(dāng)方法存在系統(tǒng)誤差（標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過原點），單點校正法的誤差較大。第十五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三標(biāo)準(zhǔn)曲線法優(yōu)點

繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線后測定工作就很簡單了，適合大量樣品的分析。缺點

1、每次樣品分析的色譜條件很難完全相同，容易出現(xiàn)誤差；

2、繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線一般使用待測組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品，對樣品前處理過程中待測組分的變化無法進(jìn)行補償。第十六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法——選擇適宜的物質(zhì)作為欲測組分的參比物，定量加到樣品中去，依據(jù)欲測組分和參比物在檢測器上的響應(yīng)值（峰面積或峰高）之比和參比物加入的量進(jìn)行定量分析的方法。內(nèi)標(biāo)法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法相比，有利于消除色譜條件不完全重現(xiàn)、進(jìn)樣量不準(zhǔn)確等所帶來的誤差。第十七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。內(nèi)標(biāo)物的選擇條件：

1、內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是原樣品中不存在的純物質(zhì)，該物質(zhì)的性質(zhì)應(yīng)盡可能與待測組分相近，不與被測樣品起化學(xué)反應(yīng)，同時要能完全溶于被測樣品中；

2、內(nèi)標(biāo)物的峰應(yīng)盡可能接近待測組分的峰，或位于幾個待測組分的峰中間，但必須與樣品中所有峰不重疊，完全分開；

3、內(nèi)標(biāo)物的加入量應(yīng)與待測組分相近。第十八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法——為使內(nèi)標(biāo)法適用于大量樣品分析，可將內(nèi)標(biāo)法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法結(jié)合。具體做法

1、配制待測組分的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入同樣量的內(nèi)標(biāo)物；

2、在相同色譜條件下分別測定加入內(nèi)標(biāo)的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；

3、以待測組分與內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)作圖，繪制內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

4、分析樣品時，取和繪制內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相同體積的樣品和相同量的內(nèi)標(biāo)物，在相同的色譜條件下測定；

5、得到樣品溶液中待測組分和內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)值之比，由此值在內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查出樣品中待測組分的濃度，進(jìn)而算出待測組分在樣品中的含量。第十九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三內(nèi)標(biāo)法優(yōu)點

進(jìn)樣量變化、色譜條件的微小變化對內(nèi)標(biāo)法定量結(jié)果影響不大；在樣品前處理前加入內(nèi)標(biāo)物，再進(jìn)行樣品前處理，可不分補償待測組分在樣品前處理時的損失。缺點

選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物很困難；使用內(nèi)標(biāo)物的操作比較麻煩。內(nèi)標(biāo)法定量比標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量的準(zhǔn)確度和精密度都要好。第二十頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三標(biāo)準(zhǔn)加入法標(biāo)準(zhǔn)加入法——實際上是一種特殊的內(nèi)標(biāo)法，是在選擇不到合適的內(nèi)標(biāo)物時，以待測組分的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加入待測組分純物質(zhì)前后待測組分的峰面積（或峰高），從而計算待測組分在樣品中的含量。第二十一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三標(biāo)準(zhǔn)加入法優(yōu)點

1、不需要另外的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物；

2、如在樣品前處理前就加入已知準(zhǔn)確量的待測組分，則可完全補償待測組分在前處理過程中的損失。缺點

要求兩次測定的色譜條件、進(jìn)樣量完全相同。第二十二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性的因素樣品制備

1、干擾物質(zhì)盡可能的分離出去；

2、樣品中的待測組分能否盡可能多的轉(zhuǎn)入制備好的樣品溶液中；

3、樣品制備和儲存過程中防止損失和被玷污

4、采用衍生化技術(shù)時，反應(yīng)一定是定量的。第二十三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性的因素進(jìn)樣技術(shù)

1、采用歸一化法、內(nèi)標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法時，進(jìn)樣的誤差可以被這些方法的本身的特性所消除；

2、進(jìn)樣對標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析的影響主要有以下兩個因素：

a.進(jìn)樣裝置的準(zhǔn)確性和精度

b.分析人員對進(jìn)樣技術(shù)掌握的熟練程度第二十四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性的因素色譜條件的選擇

1、在分離度良好的條件下，柱效的變化對峰面積定量沒有影響，對峰高定量會產(chǎn)生影響；

2、流動相流速變化對歸一化法、內(nèi)標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法定量結(jié)果無影響，但對標(biāo)準(zhǔn)曲線法的定量結(jié)果有影響，而且其對峰面積定量結(jié)果的影響比對峰高影響大，因此，在流動相流速不易控制時，如采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，宜采用峰高法定量；

3、氣相色譜中，柱溫會影響保留時間和峰高，且其對峰高的影響隨分子量的增加而增大。但柱溫對峰面積大小影響較小，所以在氣相色譜中多采用峰面積定量。第二十五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性的因素檢測器特性

檢測器工作的穩(wěn)定性和線性范圍將直接影響色譜定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

1、進(jìn)樣量不能使待測組分的響應(yīng)值超出檢測器的線性范圍，選用的進(jìn)樣量最好能使檢測器的響應(yīng)值落到其線性范圍的中間部分，此時誤差最??；

2、選擇適當(dāng)?shù)臋z測器和檢測器的工作參數(shù)，使定量分析結(jié)果由檢測器引起的誤差降到最低。第二十六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三色譜定量分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理誤差和準(zhǔn)確度

誤差（絕對誤差和相對誤差）是用來表示定量分析結(jié)果準(zhǔn)確度的量度，即定量分析結(jié)果與真值的符合程度。評價定量分析結(jié)果準(zhǔn)確度的常用方法

1、利用標(biāo)準(zhǔn)樣品（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）來評價定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確度；

2、利用測定回收率的方法來評價定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。第二十七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三色譜定量分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理偏差和精密度

偏差是用來評價定量分析結(jié)果精密度的量度，是對同一樣品的多次測定結(jié)果的重復(fù)性和再現(xiàn)性的評價。

偏差的表示方法很多，包括平均偏差、相對偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差等。目前較多使用的是標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，因為它對一組分析測定中的極值反應(yīng)比較靈敏，能更好的表征多次測定結(jié)果的精密度。第二十八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三色譜定量分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理準(zhǔn)確度和精密度的關(guān)系

理想的定量分析結(jié)果應(yīng)該是準(zhǔn)確度和精密度都好的分析結(jié)果。

定量分析結(jié)果的精密度高，偏差小，只能說明實驗中的隨機(jī)誤差??；系統(tǒng)誤差的大小只能通過準(zhǔn)確度來衡量，準(zhǔn)確度不好則是由于實驗中存在較大的系統(tǒng)誤差。第二十九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三色譜定量分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制——線性回歸在色譜定量分析中檢測器的響應(yīng)值與待測組分濃度應(yīng)呈線性關(guān)系，如無誤差存在，所有的點都應(yīng)在一條直線上；實際上，由于隨機(jī)誤差不可避免，特別是誤差較大，實驗點較多時，要得到一條使所有實驗點誤差都最小的直線（最佳回歸線），采用的方法是對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，求出回歸方程，再配線作圖。當(dāng)自變量為一個時稱為一元回歸。色譜定量分析中繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的過程就是一元線性回歸方程的求解和配線過程。

第三十頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三色譜定量分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理線性回歸方程y=ax+bb稱回歸系數(shù)，是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率；a是常數(shù)項，是回歸直線的截距，此項應(yīng)很小接近零，a值過大說明實驗過程中有系統(tǒng)誤差?；貧w直線就是在所有直線中使差方和（各數(shù)據(jù)點的誤差的平方的加和）最小的那條直線，即回歸直線的系數(shù)b和常數(shù)項a應(yīng)使差方和達(dá)到極小值。此求回歸直線的方法通常被稱為最小二乘法。第三十一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期三色譜定量分析結(jié)果數(shù)據(jù)處理相關(guān)系數(shù)——用來表示線性關(guān)系的好壞程度相關(guān)系數(shù)越接近1，說明線性關(guān)系越好色譜定量分析繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時需要計算相關(guān)系數(shù)，只有當(dāng)相關(guān)系數(shù)大于某個限定值，才能說明配出的回歸直線是有意義的。

繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時一般選取3-6個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，相關(guān)系數(shù)起碼應(yīng)在0.95以上。如達(dá)不到要求，可能存在以下原因：

1、所選濃度范圍使檢測器的響應(yīng)值超出了該檢測器響應(yīng)值的線性范圍；

2、實驗數(shù)據(jù)的精密度太差，過于分散。

無