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文檔簡介
蛋白質的純化方法及常用設備簡介報人:李保健牛瑩瑩①蛋白質純化原則目②2蛋白質純化的前處理蛋白質純化的粗分離④蛋白質純化的細分離⑤純化過程的注意事項蛋白質純化原則蛋白純化要利用不同蛋白間內在的相似性與差異,利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質的污染,而利用各蛋白質的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學活性都會有差異,利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來得到重組蛋白蛋白質純化的前處理anath(一)材料的預處理及細胞破碎分離提純某一種蛋白質時,首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態,不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。破碎組織細胞的常用方法機械破碎法利用機械力的剪切作用,常用設備有,高速組織搗碎這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。滲透破碎法反復凍融法知銀線經結后,細法影面熙些對溫度變化敏感的蛋白質不宜采用此法。使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。超聲波法酶法如用溶菌酶壞微生物細胞利用組織細胞和微生物的自身系,在一自溶法定的pH值和溫度下,使紐胞裂解表面活性劑處表面活性劑能與脂蛋白形成微泡,使胞膜通理法透性改變而導致細胞溶解反復凍融法將待破碎的細胞置-20℃冰箱內完全凍結,然后在室溫融化,如此反復2-3次,大部分組織細胞及細胞內顆粒可被融破,此法主要適用于對組織細胞的處理。如果要提取細菌或病毒中的蛋白或核酸,可用類似的冷熱交替法,先將細胞置于沸水浴中,90℃左右維持數分鐘,然后立即置于冰浴中使之迅速冷卻,絕大部分細胞被破碎超聲破碎法利用超聲波的機械振動使流體形成局部減壓發生內部流動、漩渦生成和消失,產生足以使細胞破碎的壓力。超聲波所使用的頻率為1-20kHz不等。一次超聲處理1-2分鐘,總時間為10-15分鐘優點:超聲破碎法操作簡單、省時且作用較溫和般組織細胞皆易破碎,而細菌,尤其是真菌的厚膜孢子則較難打破。超聲破碎時需間歇進行以避免長時間產熱使抗原破壞自溶法利用組織細胞和微生物的自身酶系,在一定的pH值和溫度下,使細胞裂解。動物組織細胞自溶的溫度常選用0-4℃,對微生物常選用室溫。自溶時需加入少量防腐劑,如甲苯、氯仿等疊氮鈉能抑制美的活力,不宜使用酶處理法溶菌酶在堿性條件下,能溶解革蘭陽性菌的細胞壁,有EDIA存在時,溶菌酶也能溶解某些革蘭氏陰性菌的細胞壁;纖維素酶主要溶解真菌細胞壁;蝸牛酶能溶解酵母菌細胞壁和植物細胞壁。優點:酶處理法具有作用條件溫和,內含物成分不易受破壞,細胞壁損壞程度可以控制等特點表面活性劑處理法:在適當的溫度、pH值和低離子強度的條件下,表面活性劑能與脂蛋白形成微泡,使細胞膜通透性改變而導致細胞溶解
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