一、基本概念1、提?。豪眠m當(dāng)?shù)娜軇┗蚍椒ǎ瑢⑺煞直M可能從原料中完全提出的過(guò)程。2、分離：將提取物中所含的各種成分一一分開(kāi)，并將得到的單體加以精制的過(guò)程。第一節(jié)植物源農(nóng)藥的提取當(dāng)前第1頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

水親水性有機(jī)溶劑親脂性有機(jī)溶劑二、提取方法超臨界流體萃取法（SFE）水蒸氣蒸餾法溶劑提取法升華法壓榨法溶劑當(dāng)前第2頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（一）溶劑提取法根據(jù)天然成分的溶解性不同，選用對(duì)所需成分溶解度大而對(duì)其他成分溶解度小的溶劑，將所需成分從生物材料中溶解出來(lái)的一種提取方法。

當(dāng)前第3頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

溶劑提取是指溶劑進(jìn)入生物體細(xì)胞，溶解或分散其有用物質(zhì)而變成浸出物的全過(guò)程。包括浸潤(rùn)、解吸和擴(kuò)散三個(gè)階段。1、溶劑提取法的原理選擇溶劑依據(jù)相似相溶原理。當(dāng)前第4頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

浸潤(rùn)：滲透階段溶劑通過(guò)細(xì)胞壁滲透到細(xì)胞中。解吸：溶解階段細(xì)胞內(nèi)容物與細(xì)胞組織之間有親和力，溶劑破除這種親和力。擴(kuò)散：置換階段利用細(xì)胞內(nèi)的滲透力產(chǎn)生的壓差而抽提出來(lái)，用溶劑占領(lǐng)內(nèi)容物的位置而將內(nèi)容物置換出來(lái)。當(dāng)前第5頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

擴(kuò)散過(guò)程表達(dá)式：dt:擴(kuò)散時(shí)間F：擴(kuò)散面積，以粉碎度表示濃度差D：擴(kuò)散系數(shù)ds:在dt時(shí)間內(nèi)的擴(kuò)散量當(dāng)前第6頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)2、選擇溶劑的要點(diǎn)*對(duì)所要成分溶解度大*沸點(diǎn)適中容易回收*低毒安全*廉價(jià)天然產(chǎn)物成分中，萜、甾等大環(huán)、稠環(huán)化合物極性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等極性溶劑中；酸堿性成分因存在狀態(tài)不同溶解性不同。最常用的溶劑為乙醇。當(dāng)前第7頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)3、溶劑的分類*強(qiáng)極性溶劑：水*親水性有機(jī)溶劑：能與水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮）*親脂性有機(jī)溶劑：不與水任意混溶，可分層（正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、環(huán)己烷、石油醚）常用溶劑的極性大小順序：石油醚<四氯化碳<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇（甲醇）<水當(dāng)前第8頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)4、化合物的結(jié)構(gòu)與親水性、親脂性的關(guān)系（1）分子結(jié)構(gòu)中親水性基團(tuán)（羧基、羥基、氨基）越多，極性越大，親水性越強(qiáng)，反之則親脂性越強(qiáng)。（2）分子中非極性部分越大，碳鏈越長(zhǎng)或結(jié)構(gòu)越大，則親脂性越強(qiáng)。（3）結(jié)構(gòu)母核相同的成分，分子中功能基的極性越大，或極性功能基數(shù)量越多，則整個(gè)分子的極性越大，親水性越強(qiáng)，親脂性越弱。當(dāng)前第9頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)5、溶劑的選擇

(1)水：為價(jià)廉、易得、使用安全的強(qiáng)極性溶劑。適于提取無(wú)機(jī)鹽、糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸鹽、生物堿鹽、苷類等。(2)親水性有機(jī)溶劑：以乙醇最常用。高濃度提取親脂性成分，低濃度提取親水性成分。(3)

親脂性有機(jī)溶劑：具有較強(qiáng)的選擇性，對(duì)揮發(fā)油、油脂、葉綠素、樹(shù)脂、內(nèi)酯、某些生物堿及一些苷元均可提取出來(lái)。優(yōu)缺點(diǎn)：沸點(diǎn)低，濃縮回收方便，但易燃、有毒、價(jià)貴，穿透力差。當(dāng)前第10頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)6、溶劑提取的方法溶劑提取的方法連續(xù)回流提取法煎煮法（煎中藥）滲漉法浸漬法（泡藥酒）當(dāng)前第11頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

以水或稀醇反復(fù)提取，適于遇熱易破壞或揮發(fā)性成分及含淀粉、粘液質(zhì)較多的材料。（1）浸漬法

民間的藥酒浸制。當(dāng)前第12頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

（2）滲漉法

以稀乙醇或酸、水作溶劑，先浸后滲，提取效率高于浸漬法。但溶劑用量大，對(duì)原料粒度要求高。實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)單滲漉裝置當(dāng)前第13頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

（3）煎煮法

以水為溶劑，對(duì)遇熱易破壞和揮發(fā)性成分有影響，對(duì)含多量淀粉、黏液質(zhì)的原料也不適用。

傳統(tǒng)的中藥煎制。當(dāng)前第14頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

（5）連續(xù)回流提取法

循環(huán)使用揮發(fā)性的有機(jī)溶劑，在脂肪提取器中連續(xù)提取的方法。提取效率高，節(jié)省溶劑。但不適于熱不穩(wěn)定成分的提取。

也可采用混合溶劑，常用的有水和乙醇。不同比例的溶劑可提出不同成分，如CHCl3-C2H5OH(95:5) 可提取出強(qiáng)心甙、有機(jī)酸、葉綠素等。當(dāng)前第15頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

索式提取器的組成當(dāng)前第16頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)索式提取器連續(xù)回流提取

萃取瓶（圓底燒瓶）冷凝管脂肪提取器濾紙筒虹吸管蒸汽管當(dāng)前第17頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

7、影響溶劑提取法的因素（1）生物材料的粉碎度

材料細(xì)，面積大，擴(kuò)散快，效果好。但是太細(xì)，吸附作用大，易糊化，擴(kuò)散慢，同時(shí)植物細(xì)胞也會(huì)遭受破壞，大量蛋白質(zhì)、淀粉被提出，產(chǎn)生沉淀或膠束狀，影響提取?；?、葉可適當(dāng)粗些，皮、莖、根宜細(xì)些。當(dāng)前第18頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

（2）提取溫度

一般使用常溫，在不破壞有效成分的條件下加熱不要超過(guò)80?C。

溫度低提取時(shí)的雜質(zhì)少，溫度高時(shí)提取效率高；但含淀粉、粘液質(zhì)較多的材料，水提時(shí)避免熱提。當(dāng)前第19頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

（3）提取時(shí)間

以提完為準(zhǔn)，是否完全可以提取也做定性實(shí)驗(yàn)，或薄層層析檢測(cè)，或以液體顏色判斷。

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確定是否需要延長(zhǎng)提取時(shí)間。當(dāng)前第20頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

（4）濃度差

根據(jù)擴(kuò)散原理，造成提取液的濃度差可以提高提取的效率。

可采取的措施有：攪拌、更換溶劑。當(dāng)前第21頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

（5）新技術(shù)的使用

超聲波、微波促提技術(shù)的應(yīng)用，可以加快提取速度，提高提取效率。

目前實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的超聲波萃取儀是將超聲波換能器產(chǎn)生的超聲波通過(guò)介質(zhì)（通常是水）傳遞并作用于樣品，這是一種間接的作用方式，聲振強(qiáng)度較低，必須通過(guò)增加超聲波發(fā)生器功率（3300W）來(lái)提高萃取效率。但較大的超聲波功率，又會(huì)發(fā)出令人感覺(jué)不適的噪音。

超聲波促提原理：當(dāng)前第22頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

為物理過(guò)程，無(wú)化學(xué)反應(yīng)，不改變生物活性，高能量的超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)大壓力，可造成植物細(xì)胞壁及生物體破裂，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)釋放、擴(kuò)散、溶解。實(shí)驗(yàn)室用小型超聲儀工業(yè)生產(chǎn)用超聲儀當(dāng)前第23頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

微波輔助技術(shù)是利用樣品中目標(biāo)物分子在微波電磁場(chǎng)的作用下，從原來(lái)的熱運(yùn)動(dòng)狀態(tài)轉(zhuǎn)為跟隨微波交變電磁場(chǎng)而快速排列取向，將微波能量轉(zhuǎn)化為樣品內(nèi)的能量，從而加速目標(biāo)物從固相進(jìn)入溶劑相的過(guò)程。微波促提原理：當(dāng)前第24頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

具有穿透力強(qiáng)，加熱效率高，操作簡(jiǎn)便、快速、節(jié)能、高效等特點(diǎn)。缺點(diǎn)：化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)易發(fā)生變化，繼而導(dǎo)致生物活性的改變。

微波提取尤其要注意能量的控制，被提取物質(zhì)的穩(wěn)定性。工業(yè)生產(chǎn)用微波提取罐當(dāng)前第25頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

（二）水蒸氣蒸餾法

適于具有揮發(fā)性，能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞的有效成分結(jié)構(gòu)的提取。如揮發(fā)油、小分子生物堿、酚類、游離醌類等。

水蒸氣蒸餾法是將水蒸氣通入不溶或難溶于水但有一定揮發(fā)性的有機(jī)物質(zhì)中，使該有機(jī)物在低于100℃

的溫度下，隨著水蒸氣一起蒸餾出來(lái)。原理：道爾頓分壓定律當(dāng)前第26頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

水蒸氣蒸餾裝置

常用的水蒸氣蒸餾裝置，包括水蒸氣發(fā)生器、蒸餾、冷凝和接受器四個(gè)部分。當(dāng)前第27頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

最常用的是二氧化碳超臨界萃取法，環(huán)保、成本低、提取分離一步完成。分子的極性、沸點(diǎn)和分子量的大小與其在二氧化碳超臨界流體中的溶解性密切相關(guān)。（三）超臨界流體萃取法

超臨界二氧化碳流體(SFE-CO2)臨界點(diǎn)(31.1℃)相當(dāng)接近室溫當(dāng)前第28頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

利用超臨界條件下流體的特殊性能對(duì)樣品進(jìn)行提取，是20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展起來(lái)的一種提取方法。

超臨界流體不但具有與液體接近的密度，有很強(qiáng)的穿透性，接近或超過(guò)溶劑的提取效率；而且具有與氣體相近的擴(kuò)散的性能，提取效率越高。常用的超臨界流體有CO2、乙烷、丙烷等。當(dāng)前第29頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

與普通有機(jī)溶劑提取法相比，超臨界CO2萃取技術(shù)具有無(wú)毒、常溫、不易燃、無(wú)污染等特點(diǎn)，可確保原有的色、香、味不因受熱破壞；更為可貴的是在萃取過(guò)程中可同時(shí)對(duì)萃取物進(jìn)行分離純化。該技術(shù)適宜于萃取高價(jià)值的油脂（包括天然功能性油脂）、精油、內(nèi)酯等極性較低的天然產(chǎn)物有效成分。

超臨界CO2提取的特點(diǎn)。當(dāng)前第30頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

CO2

鋼瓶

冷溫槽

高壓泵恒溫箱

控溫面板

接受瓶

流量計(jì)

CO2

原料

玻璃珠

脫脂棉

萃取柱

超臨界CO2

萃取實(shí)驗(yàn)裝置示意圖當(dāng)前第31頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

液體CO2由高壓泵加壓到萃取工藝要求的壓力并傳送到換熱器，將CO2流體加溫到萃取工藝所需溫度后進(jìn)入萃取器，在此完成萃取過(guò)程。負(fù)載溶質(zhì)的CO2流體在分離器中改變溫度壓力，溶解度降低使萃取物得以分離。分離萃取物后的CO2流體再經(jīng)換熱器液化后回到儲(chǔ)罐中循環(huán)使用。超臨界CO2提取操作流程當(dāng)前第32頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

20世紀(jì)50年代初進(jìn)入試驗(yàn)階段，如從石油中脫瀝青。

70、80年代SFE用于食品香料的提取。

90年代從植物藥中提取目標(biāo)成分，如從蛇床子、桑白皮、茵陳蒿中提取活性成分。當(dāng)前第33頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

（四）升華法

將固體物質(zhì)受熱氣化，遇冷又凝結(jié)為固體的方法。樟木中的樟腦，茶葉中的咖啡因的提取。2-莰酮咖啡因當(dāng)前第34頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

1、將茶葉與95%乙醇回流2h；2、濾出茶葉，濃縮提取液至適當(dāng)體積；3、濃縮液與生石灰粉混合，攪成漿狀，用蒸發(fā)皿在蒸汽浴上蒸干，除去水份；4、在蒸發(fā)皿上蓋一張刺孔向上的濾紙，再在濾紙上罩一個(gè)大小適合且頸部塞有棉花的漏斗；5、用酒精燈隔石棉網(wǎng)加熱，適當(dāng)控制溫度，白色咖啡因在濾紙上結(jié)晶。實(shí)驗(yàn)室提取咖啡因步驟：當(dāng)前第35頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

當(dāng)前第36頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)升華當(dāng)前第37頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

借助機(jī)械外力的作用，將油脂從榨料中擠壓出來(lái)的過(guò)程。在壓榨過(guò)程中，主要發(fā)生的是物理變化，如物料變形、油脂分離、摩擦發(fā)熱、水分蒸發(fā)等。但由于溫度、水分、微生物等的影響，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生某些生物化學(xué)方面的變化，如蛋白質(zhì)變性、酶的鈍化和破壞、某些物質(zhì)的結(jié)合等。壓榨時(shí)，榨料粒子在壓力作用下內(nèi)外表面相互擠緊，致使其液體部分和凝膠部分分別產(chǎn)生兩個(gè)不同過(guò)程，即油脂從榨料空隙中被擠壓出來(lái)及榨料粒子變形形成堅(jiān)硬的油餅。（五）壓榨法當(dāng)前第38頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

第二節(jié)天然產(chǎn)物的分離與精制一、一般分離方法1、萃取法2、沉淀分離法3、結(jié)晶和重結(jié)晶4、膜分離二、柱色譜法1、吸附柱色譜2、分配柱色譜3、離子交換柱色譜4、凝膠柱色譜5、大孔樹(shù)脂柱色譜6、親和柱色譜當(dāng)前第39頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

1)影響分離的因素①分離因子β，分配系數(shù)Kβ=Ka/Kb，Ka>Kb

K=CU/CL

CU、CL為被分離物質(zhì)在上相和下相中濃度

1、萃取法

利用混和物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離的方法。當(dāng)前第40頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

根據(jù)β值的大小可決定分離采用的方法

β>100,簡(jiǎn)單的一次萃取，可基本分離。β≈10，數(shù)次乃至10余次萃取，CCD法β≦2，100次以上萃取，DCCC法，HSCCC法β≈1，不能分離可以根據(jù)PC法計(jì)算β值，選擇理想的分離條件。當(dāng)前第41頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)2.沉淀分離法根據(jù)溶解度的不同，控制溶液條件使溶液中的化合物或離子分離的方法統(tǒng)稱為沉淀分離法。方法的主要依據(jù)是溶度積原理。當(dāng)前第42頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)根據(jù)沉淀劑的不同，沉淀分離也可以分成用無(wú)機(jī)沉淀劑的分離法、用有機(jī)沉淀劑的分離法和共沉淀分離富集法。沉淀分離法和共沉淀分離法的區(qū)別主要是：沉淀分離法主要使用于常量組分的分離（毫克量級(jí)以上）；而共沉淀分離法主要使用于痕量組分的分離（小于1mg/mL）。常用的沉淀分離方法及試劑1、無(wú)機(jī)沉淀劑氫氧化物、硫化物、其它沉淀劑。2、有機(jī)沉淀劑草酸、銅試劑、銅鐵試。當(dāng)前第43頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)3.結(jié)晶和重結(jié)晶在化學(xué)里面，熱的飽和溶液冷卻后，溶質(zhì)以晶體的形式析出，這一過(guò)程叫結(jié)晶。重結(jié)晶是將晶體溶于溶劑或熔融以后，又重新從溶液或熔體中結(jié)晶的過(guò)程。重結(jié)晶可以使不純凈的物質(zhì)獲得純化，或使混合在一起的鹽類彼此分離。當(dāng)前第44頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)重結(jié)晶提純法的一般過(guò)程1、溶劑選擇2、固體物質(zhì)的溶解3、雜質(zhì)的除去4、晶體的析出5、晶體的收集和洗滌6、晶體的干燥當(dāng)前第45頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)4.膜分離利用膜的選擇性分離實(shí)現(xiàn)料液的不同組分的分離、純化、濃縮的過(guò)程稱作膜分離①液膜分離過(guò)程分為乳化液膜和固定液膜的分離過(guò)程；②合成膜的分離過(guò)程包括微過(guò)濾、超過(guò)濾、反滲透、氣體滲透分離、滲透蒸發(fā)、滲析及電滲析等過(guò)程。當(dāng)前第46頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

二：柱色譜1.吸附柱色譜

吸附分類物理吸附：無(wú)選擇性吸附，吸附-解吸附發(fā)生迅速，吸附劑如硅膠、氧化鋁、活性炭等；化學(xué)吸附：不可逆吸附，如堿性氧化鋁對(duì)酚酸性成分的吸附；酸性硅膠對(duì)生物堿的吸附等；半化學(xué)吸附：聚酰胺對(duì)酚酸類、醌類的氫鍵吸附。當(dāng)前第47頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

吸附原理：相似相吸

影響吸附過(guò)程的三要素：吸附劑（固定相）溶質(zhì)（被分離物質(zhì)）溶劑（洗脫劑、展開(kāi)劑、流動(dòng)相）

當(dāng)前第48頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

2、硅膠、氧化鋁

極性吸附劑：載樣量大，吸附力強(qiáng)硅膠：有中性、酸性之分，適用于各類成分分離。氧化鋁：有中性、酸性、堿性之分，不適合于分離酸性成分，多用于分離生物堿。當(dāng)前第49頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

①被分離物質(zhì)吸附力與結(jié)構(gòu)的關(guān)系

被分離物質(zhì)極性大，吸附力強(qiáng)，難洗脫，Rf值小。官能團(tuán)極性大小排列順序：-COOH>Ar-OH>R-OH>R-NH2、RNHR’、RNR’R’’>RCONRR’>RCHO>RCOR’>RCOOR’>ROR’>RH②溶劑（洗脫劑）的極性與洗脫力的關(guān)系洗脫劑極性越大，洗脫力越強(qiáng)；當(dāng)前第50頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

大黃酸大黃素大黃酚酸性最強(qiáng)酸性其次酸性最弱溶于NaHCO3溶于Na2CO3溶于NaOH當(dāng)前第51頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

例：從黃花夾竹桃果仁中分離到七種強(qiáng)心苷成分，根據(jù)極性大小推測(cè)從硅膠柱上的洗脫順序。

名稱RR’黃夾苷ACHO(D-glc)2黃夾苷BCH3(D-glc)2黃夾次苷ACHOH黃夾次苷BCH3H黃夾次苷CCH2OHH黃夾次苷DCOOHH單乙酰黃夾次苷BCH3H

單乙酰黃夾次苷BR’’=COCH3, 其它R’’=H當(dāng)前第52頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

3、活性炭----非極性吸附劑

①吸附力與結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子量大者>分子量小者芳香族>脂肪族，活性炭和芳香族均有平面型分子的緣故。含OH、COOH、NH2多者>少者當(dāng)前第53頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

3、活性炭----非極性吸附劑

②溶劑的洗脫力

吡啶>15%酚/醇>7%酚/H2O>醇>含水醇>H2O黃酮、生物堿的富集，糖的分離，脫色等。③應(yīng)用當(dāng)前第54頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

4、聚酰胺（Polyamide）

由己酰胺聚合成的一類高分子化合物。分離原理：主要通過(guò)酰胺與酚、酸、醌等化合物形成氫鍵，吸附能力取決于氫鍵的強(qiáng)弱。當(dāng)前第55頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)2.分配柱色譜液-液柱色譜法，其固定相和流動(dòng)相均為液體，液態(tài)固定相又稱固定液，被涂漬在惰性材料載體上構(gòu)成固定相。分配柱色譜法的優(yōu)點(diǎn)是：穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好，適用樣品的類型廣等。

當(dāng)前第56頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

固定相極性小于流動(dòng)相，如HPLC反相色譜柱、反相薄層色譜板。固定相：硅膠的硅醇基與烷基結(jié)合，如RP-2、RP-8、RP-18，親脂性：RP-18>RP-8>RP-2流動(dòng)相（洗脫劑）：MeOH-H2O；CH3CN-H2O洗脫順序：分離極性大的成分，極性大者先被洗脫出來(lái)。當(dāng)前第57頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

固定相的表面修飾

當(dāng)前第58頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)3.離子交換色譜離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團(tuán)，這些帶電基團(tuán)通過(guò)靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。如果流動(dòng)相中存在其他帶相反電荷的離子，按照質(zhì)量作用定律，這些離子將與結(jié)合在固定相上的反離子進(jìn)行交換。固定相基團(tuán)帶正電荷的時(shí)候，其可交換離子為陰離子，這種離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團(tuán)帶負(fù)電荷，可用來(lái)與流動(dòng)相交換的離子就是陽(yáng)離子，這種離子交換劑叫做陽(yáng)離子交換劑。當(dāng)前第59頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)陰離子交換柱的功能團(tuán)主要是－NH2，及－NH3：陽(yáng)離子交換劑的功能團(tuán)主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3離子交換柱及-SO3H離子交換劑屬于強(qiáng)離子交換劑，它們?cè)诤軓V泛的pH范圍內(nèi)都有離子交換能力；-NH2及-COOH離子交換柱屬于弱離子交換劑，只有在一定的pH值范圍內(nèi)，才能有離子交換能力。離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離，例如，氨基酸自動(dòng)分析儀中的色譜柱，多肽的分離、蛋白質(zhì)的分離，核苷酸、核苷和各種堿基的分離等。

當(dāng)前第60頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

4、凝膠層析（GelPenetrationChromatography,GPC）

①葡聚糖凝膠

交聯(lián)葡聚糖是由一定平均分子量的葡聚糖和交聯(lián)劑（一般為環(huán)氧氯丙烷）以醚橋的形式互相交聯(lián)形成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)高分子材料，是水不溶性的白色球狀顆粒，酸性環(huán)境能水解，堿中穩(wěn)定。

在樣品通過(guò)一定孔徑的凝膠固定相時(shí)，由于流經(jīng)路徑的不同，使不同相對(duì)分子量的組分得以分離的方法。當(dāng)前第61頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

表面有孔隙，其大小決定于聚糖與交聯(lián)劑的配比及反應(yīng)條件。

商品型號(hào)即按凝膠的交聯(lián)度大小分類，并以吸水量來(lái)表示，英文字母G代表葡聚糖凝膠，后面的數(shù)字表示每克凝膠吸水量，再乘以10的值，G-25的吸水量為每克2.5ml。

交聯(lián)度大→網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密→孔隙越小→吸水膨脹越少。當(dāng)前第62頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

型號(hào)吸水量（ml/g）床體積（ml/g）分離范圍最小溶脹時(shí)間肽與蛋白質(zhì)多糖室溫沸水G-101.02~3小于700小于70031G-151.52.5~3.5小于1500小于150031G-252.54~61000~5000100~500062G-505.09~111500~3萬(wàn)500~1萬(wàn)62G-757.512~153000~7萬(wàn)1000~5萬(wàn)243G-1001015~20400015萬(wàn)1000`10萬(wàn)485G-1501520~305000~40萬(wàn)1000~15萬(wàn)725G-2002030~405000~80萬(wàn)1000~20萬(wàn)725凝膠的型號(hào)與使用范圍當(dāng)前第63頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

②層析原理

絕大部分在水溶液中進(jìn)行，凝膠顆粒在適當(dāng)溶劑中浸泡，待充分膨脹后裝入層析柱，加樣后用同一溶液洗脫。在洗脫過(guò)程中，較小的分子滲入凝膠，較大的分子隨溶液流動(dòng)，分子量小的物質(zhì)（阻滯作用大）可通過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入粒子內(nèi)部，然后擴(kuò)散出來(lái)，故流程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，后流出色譜柱，分子量大的物質(zhì)沉凝膠粒子間孔隙，隨洗脫液移動(dòng)，流程短，移動(dòng)速度快，先流出色譜柱。當(dāng)前第64頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

不同的化合物由于其大小差異，在流經(jīng)GPC柱時(shí)，不同分子量的化合物流經(jīng)體積不同（大分子不能或難以進(jìn)入凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，直接從凝膠顆粒之間穿過(guò)，保留時(shí)間短；而小分子恰恰相反，保留時(shí)間較長(zhǎng)）而得以分離。當(dāng)前第65頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

常用術(shù)語(yǔ)Vt——床體積，凝膠裝柱以后，柱床所占的體積。Vo——外水體積，柱床內(nèi)存在于凝膠外面的水相體積。Vi——內(nèi)水體積，凝膠顆粒內(nèi)部所含的水相體積。Vg——凝膠本身體積。相互關(guān)系：Vt=Vo+Vi+VgVe——洗脫體積，自樣品加入時(shí)算起，至流出組分最大濃度出現(xiàn)時(shí)，所流出的體積。當(dāng)前第66頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

同一類型化合物，洗脫特征與組分分子量有關(guān)。

Ve=K1-K2logM

說(shuō)明不同組分流經(jīng)凝膠柱時(shí)，按分子量大小順序流出，分子量大的，洗脫體積小，最先流出，當(dāng)條件固定時(shí)，Ve重現(xiàn)性很好。

按此特性可測(cè)大分子物質(zhì)的分子量。當(dāng)前第67頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

用已知分子量的物質(zhì)分別相繼上柱（5mg），流出液按每管2~4ml收集，通過(guò)硫酸蒽酮顯色，再經(jīng)紫外檢測(cè)，分別求得洗脫體積Ve。再用藍(lán)色葡聚糖測(cè)出柱床的外水體積Vo，按Ve/Vo與分子量對(duì)數(shù)關(guān)系作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后將待測(cè)物質(zhì)分子量用少水溶解上柱，在同樣條件下測(cè)定Ve，根據(jù)Ve/Vo，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得物質(zhì)分子量。局限性：

1、要有標(biāo)準(zhǔn)樣。

2、不同的待測(cè)物質(zhì)要有不同的標(biāo)準(zhǔn)樣。當(dāng)前第68頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

操作技術(shù)：溶脹：不同凝膠溶脹時(shí)間不一樣，G-100室溫下最小水化時(shí)間72h，除微顆粒。目的：充分吸水，各孔隙舒張，以利于物質(zhì)分子通過(guò)。裝柱：柱內(nèi)加少量洗脫液，排除底部氣泡，然后將凝膠漿倒入，讓其自然沉降，打開(kāi)出口，柱床表面不再下沉即緊密。裝好的柱應(yīng)不含氣泡，柱床表面平坦。當(dāng)前第69頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

平衡：用3倍床體積洗脫液讓柱平衡流動(dòng)2-3天，至流速恒定。加樣：平衡后，床表面應(yīng)有1~2cm的洗脫液，用吸管沿柱壁加入，打開(kāi)出口，當(dāng)上面液體剛好全部滲入柱內(nèi)時(shí)，滴加洗脫液，注意不能振動(dòng)床表面。

上樣品要體積小，濃度大，這樣峰形好。當(dāng)前第70頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)

洗脫：一般用水和電解質(zhì)溶液，如酸、堿、鹽的溶液及緩沖溶液。加入5cm以上洗脫液時(shí)，可接高位瓶中的洗脫液，洗脫分階段洗脫和梯度洗脫收集：分部收集器收集。檢出：蛋白質(zhì)、核苷酸、多肽用紫外光譜儀在280nm、260nm、230nm測(cè)吸光度值，以樣品體積（或管數(shù)）為橫座標(biāo)，吸光度為縱座標(biāo)，畫出洗脫曲線。當(dāng)前第71頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)5、大孔樹(shù)脂柱色譜大孔吸附樹(shù)脂的吸附實(shí)質(zhì)為一種物體高度分散或表面分子受作用力不均等而產(chǎn)生的表面吸附現(xiàn)象，這種吸附性能是由于范德華引力或生成氫鍵的結(jié)果。同時(shí)由于大孔吸附樹(shù)脂的多孔結(jié)構(gòu)使其對(duì)分子大小不同的物質(zhì)具有篩選作用。通過(guò)上述這種吸附和篩選原理，有機(jī)化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附樹(shù)脂上經(jīng)一定溶劑洗脫而達(dá)到分離、純化、除雜、濃縮等不同目的。吸附樹(shù)脂的表面發(fā)生吸附作用后，會(huì)使樹(shù)脂表面上溶質(zhì)的濃度高于溶劑內(nèi)溶質(zhì)的濃度，其結(jié)果引起體系內(nèi)放熱和自由能的下降。當(dāng)前第72頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)大孔吸附樹(shù)脂按其極性大小和所選用的單體分子結(jié)構(gòu)不同，可分為非極性、中極性和極性三類。（1）非極性大孔吸附樹(shù)脂非極性大孔吸附樹(shù)脂是由偶極矩很小的單體聚合制得的不帶任何功能基，孔表的疏水性較強(qiáng)，可通過(guò)與小分子內(nèi)的疏水部分的作用吸附溶液中的有機(jī)物，最適于極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，也稱為芳香族吸附劑，例如苯乙烯、二乙烯苯聚合物。當(dāng)前第73頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)（2）中等極性大孔吸附樹(shù)脂中等極性大孔吸附樹(shù)脂是含酯基的吸附樹(shù)脂，且多功能團(tuán)的甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑。其表面兼有疏水和親水兩部分。既可極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，又可由非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)，也稱為脂肪族吸附劑，例如聚丙烯酸酯型聚合物。（3）極性大孔吸附樹(shù)脂極性大孔吸附樹(shù)脂是指含酰胺基、氰基、酚羥基等含氮、氧、硫極性功能基的吸附樹(shù)脂，它們通過(guò)靜電相互作用吸附極性物質(zhì)，如丙烯酰胺。當(dāng)前第74頁(yè)\共有85頁(yè)\編于星期四\8點(diǎn)6.親和色譜親和色譜也稱為親和層析，是一種利用固定相的結(jié)合特性來(lái)分離分子的色譜方法。親和色譜在凝