常規培養基制作

疾控中心歲源E-mail：Tel：QQ：37316315當前第1頁\共有81頁\編于星期五\19點第一節基本理論培養基的定義：培養基是按照微生物生長繁殖或積累代謝產物所需要的各種營養物質，由人工配制而成的營養基質，它專供微生物培養、分離、鑒別、研究和保存用。培養基的用途：主要用于繁殖及分離純化細菌、傳代和保存菌種、鑒別細菌種屬、研究細菌生理及生化特性、制造菌苗、疫苗和其他微生物制劑等。當前第2頁\共有81頁\編于星期五\19點一、培養基的分類1.按用途分類：基礎培養基、營養培養基、增菌培養基、選擇性培養基、鑒別培養基、顯色培養基當前第3頁\共有81頁\編于星期五\19點基礎培養基含細菌所需最基本營養成分，可供大多數細菌生長。常用的如含適量蛋白胨、氯化鈉、磷酸鹽、的營養肉湯和營養瓊脂。營養培養基基礎培養基再加入一些其他營養成分，如葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏、生長因子等，以滿足營養要求較高的細菌生長繁殖所需要的營養。當前第4頁\共有81頁\編于星期五\19點增菌培養基多為液體培養基，主要目的是增加標本中目的菌數量，以提高目的菌檢出率。選擇性培養基在培養基中加入抑制物質，使之具有選擇性，有利于目的菌檢出和識別，而抑制其他非目的菌生長或者使其生長不佳。當前第5頁\共有81頁\編于星期五\19點加入青霉素等抗生素的培養基：分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養基：分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養基：分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養基：分離自養型微生物加入氨基嘌呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養基：分離雜交瘤細胞當前第6頁\共有81頁\編于星期五\19點鑒別培養基利用各種細菌分解糖類和蛋白質的能力及其代謝產物的不同，即生化反應能力不同，在培養基中加入特定的作用底物和指示劑，以此來區別各種細菌。主要用于檢查各種細菌的生化反應。如伊紅—美藍培養基可鑒別大腸桿菌，其代謝產物有機酸與伊紅—美藍結合，使菌落呈現綠色金屬當前第7頁\共有81頁\編于星期五\19點大腸桿菌EMB平板當前第8頁\共有81頁\編于星期五\19點沙門氏菌BS瓊脂當前第9頁\共有81頁\編于星期五\19點沙門氏菌XLD（木糖賴氨酸去氧膽酸鹽）瓊脂當前第10頁\共有81頁\編于星期五\19點顯色培養基細菌在生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性酶，按酶的特性，選用相應底物和指示劑，將其配制在相關培養基中。根據細菌反應后出現的菌落顏色變化，確定待分離可疑菌株，有助于細菌快速診斷。當前第11頁\共有81頁\編于星期五\19點副溶血性弧菌當前第12頁\共有81頁\編于星期五\19點副溶API20E當前第13頁\共有81頁\編于星期五\19點2.按物理性狀分類液體培養基流體培養基半固體培養基固體培養基當前第14頁\共有81頁\編于星期五\19點液體培養基：不含凝固劑，利于菌體的快速繁殖、代謝和積累產物流體培養基：含0.05-0.07%瓊脂粉，可降低空氣中氧進入培養基的速度，利于一般厭氧菌的生長繁殖半固體培養基：含0.2-0.8%瓊脂粉，多用于細菌的動力觀察、菌種傳代保存及貯運細菌標本材料；固體培養基：含1.5-2%瓊脂，用于細菌的分離、鑒定、菌種保存及細菌疫苗制備等多方面當前第15頁\共有81頁\編于星期五\19點液體培養基當前第16頁\共有81頁\編于星期五\19點固體培養基當前第17頁\共有81頁\編于星期五\19點半固體培養基當前第18頁\共有81頁\編于星期五\19點液體培養基：主要用于工業生產；固體培養基：主要用于分離、鑒定等；半固體培養基：主要用于觀察、保藏菌種。當前第19頁\共有81頁\編于星期五\19點3.按成分分類合成培養基由化學物質和成分已知的各種物質所組成，可以是無機鹽和有機物質等。天然培養基由化學物質不完全清楚或各批物質很難一致的天然物質所組成，如蛋白胨、牛肉膏、血液、馬鈴薯等。半合成培養基由不明化學成分的天然物質和已知化學成分的物質組成當前第20頁\共有81頁\編于星期五\19點天然培養基化學成分不明確，主要用于工業生產；合成培養基化學成分明確，主要用于分類、鑒定。當前第21頁\共有81頁\編于星期五\19點天然培養基：優點：取材便利、營養豐富、配制簡便；缺點：營養成分難以控制、實驗結果的重復性較差。天然培養基如培養細菌的牛肉膏蛋白胨培養基；血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。當前第22頁\共有81頁\編于星期五\19點合成培養基:優點：化學成分及其含量明確、實驗的可重復性好；缺點：配制繁瑣、成本較高。當前第23頁\共有81頁\編于星期五\19點二、培養基的主要成分及其作用1.營養物質：細菌在生長繁殖過程中所需要的營養成分，因細菌種類不同而異，有的對營養要求不高，僅需碳源、氮源即可；有的則要求較高，除碳源、氮源外，還需要雞蛋、血清、血液等。主要有蛋白胨、牛肉浸液、牛肉浸膏、糖醇類、血液、雞蛋和動物血清、生長因子、無機鹽類等。當前第24頁\共有81頁\編于星期五\19點1.1蛋白胨：蛋白胨是培養基中作為氮源應用最廣泛的基本成分，它用于合成菌體蛋白質、酶類以及細菌生長繁殖。其特點是易溶于水，吸水性強，故須干燥密封保存。此外，蛋白胨受高熱不凝固，遇酸不沉淀，在培養基中具緩沖作用，并含有各種游離氨基酸，易被細菌所利用。當前第25頁\共有81頁\編于星期五\19點蛋白胨是動物或植物蛋白質經酶或酸堿分解而產生的中間產物。蛋白質消化越徹底，含氨基酸越多，越有利于細菌生長繁殖。由于蛋白質來源不同，消化程度不同，制成的胨質量相差很大。通常的商品蛋白胨是由胃蛋白酶消化蛋白質而制成的含胨、多肽及多種氨基酸的混合物，可供大多數細菌生長需要。其缺點是含某些氨基酸較少。胰蛋白胨是胰蛋白酶在堿性條件下消化蛋白質所獲得的分解產物，其中含有很多氨基酸和多肽，特別是富含色氨酸，更適合作靛基質試驗用的蛋白胨水。當前第26頁\共有81頁\編于星期五\19點1.2牛肉浸液牛肉浸液是將新鮮不含脂肪、肌膜、肌腱等精牛肉浸泡煮沸制成的肉汁。包括兩類浸出物。一類為含氮可溶性浸出物（如肌酸、尿酸、腺苷酸、黃嘌呤、核苷酸、尿素、谷氨酸、肌肽等），另一類為非含氮浸出物質（如肝糖、磷酸己糖、乳糖、琥珀酸、肌醇、脂肪與無機鹽等）。牛肉浸液可作為細菌氮源和碳源，但因含氮物質較少，尚不能滿足細菌生長需要。當前第27頁\共有81頁\編于星期五\19點1.3牛肉浸膏為牛肉浸液經長時間加熱，蒸發掉水分后濃縮而成的膏狀制品。牛肉浸液中的不耐熱物質如糖類等已被破壞，因而其營養價值不如肉浸液，但其因不含糖和使用方便，故可作腸道細菌鑒別培養基基礎成分。當前第28頁\共有81頁\編于星期五\19點1.4糖、醇類糖類是細菌生長繁殖所需的碳源、能源的基本成分。最常用的單糖是葡萄糖、阿拉伯糖等；雙糖是乳糖、蔗糖等；多糖有菊糖和淀粉.醇類有甘露醇、衛矛醇等。其他的糖類和醇類主要用于發酵反應以及鑒定細菌。糖不耐熱，過久的高熱會被破壞，在堿性及與氮源一起高溫情況下，破壞更快，制備這類培養基時，通常不用高溫，并與培養基中其他成分分別滅菌。當前第29頁\共有81頁\編于星期五\19點1.5血液培養基中加入血液，可增加蛋白質、多種氨基酸、糖類、無機鹽等營養成分，同時還能提供輔酶、血紅素等特殊生長因子，供某些對營養要求高的細菌生長繁殖之用。此外，含血液的培養基還可以用于觀察細菌溶血反應，作為細菌鑒定的一項指標。當前第30頁\共有81頁\編于星期五\19點血平板溶血現象當前第31頁\共有81頁\編于星期五\19點1.6雞蛋和動物血清雞蛋和動物血清對一部分細菌來說是必須營養成分，可作為養料直接被細菌利用。常用于制備特殊培養基，如Braid-Praker瓊脂培養結核桿菌的羅氏培養基和白喉棒狀桿菌的呂氏血清培養基等。此外雞蛋和血清還具有凝固劑作用，便于觀察細菌菌落形態和生長情況。當前第32頁\共有81頁\編于星期五\19點1.7生長因子在細菌生長繁殖過程中，需要一定的輔助生長因子。生長因子根據化學結構及代謝功能不同分為三大類：維生素、氨基酸和嘌呤與嘧啶。細菌對這些物質需要量不大，但如缺少，某些細菌就不能生長。通常肝浸液、肉浸液、酵母浸液和血液中含有大部分生長因子，但有時需要另外加入。當前第33頁\共有81頁\編于星期五\19點1.8無機鹽類制備培養基時常加入氯化鈉和磷酸鹽，這是因為細菌生長繁殖需要無機鹽類，如K、Na、Mg、Fe、磷酸鹽、氯化物等。其中，有的需要量極微，如Mn、Cu等。這些無機離子除作為構成菌體的成分外，還是酶的激活劑，并起維持一定滲透壓的作用。當前第34頁\共有81頁\編于星期五\19點2.水分細菌細胞75%-80%由水組成。水是細菌營養、代謝過程中不可缺少的物質；水又是良好的溶劑，培養基中許多營養物質均需溶于水才能被細菌吸收。蒸餾水和離子交換水不含雜質，在制備培養基時，一般需使用蒸餾水和離子交換水。無蒸餾水可以用自來水代替，因其中含有某些微量元素，有利于細菌生長，但應先煮沸使部分鹽類沉淀，過濾澄清后再使用。當前第35頁\共有81頁\編于星期五\19點3.凝固物質配制固體培養基的凝固物質有瓊脂、明膠和蛋白、血清等，最常用瓊脂，特殊目的也可用明膠等。瓊脂是從石花菜等海藻中提取出來的一種膠狀物質，屬多糖類，一般不被細菌分解利用，無營養價值。瓊脂在98攝氏度以上融化，在低于45攝氏度時則凝固成膠凍狀態。用途不同的培養基中瓊脂含量不同，固體培養基含量為2%-2.5%，半固體培養基瓊脂含量為0.3%-0.5%。當前第36頁\共有81頁\編于星期五\19點4.抑制劑和指示劑抑制劑和指示劑是由于選擇、鑒定和判斷結果的需要而加入到培養基中的物質，并不為細菌生長繁殖所需。4.1抑制劑加入目的是抑制非檢出菌生長或其少生長，以利于檢出菌生長。根據所要抑制選擇不同抑制劑。常用抑制劑有膽鹽、煌綠、玫瑰紅酸、亞硫酸鈉、四硫磺酸鹽、疊氮鈉及一些染料和某些抗生素等。在選擇抑制劑時需注意抑制劑應具有選擇性抑制作用。當前第37頁\共有81頁\編于星期五\19點4.2指示劑是為方便了解和觀察細菌是否利用和分解培養基中糖、醇類物質，而在培養基中加入的成分。常用指示劑多為酸堿指示劑，如酚紅、溴甲酚紫、溴麝香草酚藍、中性紅、甲基紅、堿性復紅等，還有氧化還原指示劑，如亞甲藍。此外，一些新的氧化還原指示劑如四氮唑鹽類等，也已廣泛用于細菌快速培養和鑒定以及快速藥敏試驗方面。當前第38頁\共有81頁\編于星期五\19點三、培養基配制原則：（1）目的要明確：根據微生物的種類、培養目的等確定配制培養基的種類，因為不同的微生物對培養物質的需求不同。（2）營養要協調：注意各種營養物質的濃度和比例。（3）pH要適宜：各種微生物適宜生長的pH范圍不同。細菌pH為：；放線菌pH為：；真菌pH為：。當前第39頁\共有81頁\編于星期五\19點第二節實驗內容當前第40頁\共有81頁\編于星期五\19點一、實驗目的掌握在真菌、細菌、放線菌分離培養工作中常用的合成和半合成培養基配制的一般原理、方法、程序、環節及要求和注意事項。當前第41頁\共有81頁\編于星期五\19點二、實驗原理培養基的配制是進行微生物學實驗工作的重要基礎。由于微生物種類及代謝類型的多樣性，因而用于培養微生物培養基的種類也很多，它們的配方組成及配制方法雖各有差異,但一般培養基配制的常規程序卻大致相同，例如器皿的準備，培養基的配制與分裝，棉塞的制作，培養基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養基的無菌檢查等基本環節。當前第42頁\共有81頁\編于星期五\19點肉膏蛋白胨培養基是一種廣泛用于培養細菌的培養基，屬于半合成培養基。其主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。它們分別提供微生物生長繁殖所需要的碳源、氮源、能源、生長因子和無機鹽等。培養基都是水溶液，這是因為一切生物細胞都必須要有水的參與。當前第43頁\共有81頁\編于星期五\19點高氏一號培養基是一種用于培養放線菌的合成培養基。培養基中的可溶性淀粉作為碳源和能源，KNO3作為氮源，K2HPO4、MgSO4和FeSO4作為無機鹽等。當前第44頁\共有81頁\編于星期五\19點馬鈴薯葡萄糖培養基被廣泛用于培養酵母菌和霉菌，為半合成培養基。食品檢測國標使用虎紅培養基。當前第45頁\共有81頁\編于星期五\19點1.培養基的配制過程1.1液體培養基的配制稱量一般可用1/100粗天平稱量配制培養基所需的各種藥品。先按培養基配方計算各成分的用量然后進行準確稱量。注意：染料、指示劑、膽鹽等物質何時加入？調整pH后。溶化將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水，然后加熱溶解，并不斷用玻璃棒攪動。注意：含銅大于0.3mol/L時，細菌不易生長；含鐵大于0.14mol/L妨礙細菌產生毒素。當前第46頁\共有81頁\編于星期五\19點定容待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。問：如某種藥品用量太少如何稱量？答：可先配置成較濃溶液，然后按比例吸收一定體積溶液，加入到培養基中。當前第47頁\共有81頁\編于星期五\19點調PH一般用pH試紙測定培養基pH。用剪刀剪出一段pH紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養基中蘸一下，觀察其pH范圍，如培養基偏酸或偏堿時，可用1mol/LNaOH或1mol/LHCl溶液進行調節。注意：調節pH時，應逐漸加入NaOH或HCl溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養基中成分。邊加邊攪拌，并不時用pH試紙測試，直至達到所需pH為止。當前第48頁\共有81頁\編于星期五\19點注：一般將培養基pH調整高出所需值的個pH單位，經高壓滅菌后，其pH要降低個單位。當前第49頁\共有81頁\編于星期五\19點過濾用濾紙或多層紗布過濾培養基。一般無特殊要求時，此步可省去。當前第50頁\共有81頁\編于星期五\19點1.2固體培養基的配制配制固體培養基時，應將已配好的液體培養基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續加熱至瓊脂全部融化，最后補足因蒸發而失去的水分。當前第51頁\共有81頁\編于星期五\19點2.培養基的分裝根據不同需要，可將已配好的培養基分裝入試管或錐形瓶內，分裝時注意不要使培養基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養基沾污管口或瓶口時，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養基，并將脫脂棉棄去。當前第52頁\共有81頁\編于星期五\19點2.1試管的分裝取一個玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾住玻璃嘴，使培養基直接流入試管內。注：分裝在不同規格三角燒瓶、試管等容器中，分裝量不宜超過容器的2/3，否則會溢出。當前第53頁\共有81頁\編于星期五\19點裝入試管培養基的量，視試管大小及需要而定。若所用試管大小為15*150mm時，液體培養基可分裝至試管高度1/4左右為宜；如分裝固體或半固體培養基時，瓊脂完全融化后，應趁熱分裝于試管中。當前第54頁\共有81頁\編于星期五\19點2.2錐形瓶的分裝用于振蕩培養微生物時，可在250ml錐形瓶中加入50ml的液體培養基；若用于制作平板培養基時，可在250ml錐形瓶中加入150ml培養基，然后再加入3g瓊脂粉（按2%計算）。滅菌時瓶中瓊脂粉同時被融化。當前第55頁\共有81頁\編于星期五\19點3.棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎為了培養好氧性微生物，需提供優良通氣條件，同時為防止雜菌污染，則必須對通入試管或錐形瓶內空氣先進行過濾，除菌。通常方法是在試管及錐形瓶口加上棉花塞等。當前第56頁\共有81頁\編于星期五\19點3.1試管棉塞的制作制棉塞時，應選取用大小，厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的圓孔中，用右手食指將棉花從中央壓入圓孔中制成棉塞，然后直接壓入試管或錐形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊法制作棉塞。制作的棉塞應緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準。棉塞的2/3在試管內，1/3在試管外。當前第57頁\共有81頁\編于星期五\19點將裝好培養基并塞好棉塞或蓋好管帽的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙。用鉛筆注明培養基名稱及配制日期。滅菌待用。當前第58頁\共有81頁\編于星期五\19點3.2錐形瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時為了進行液體振蕩培養加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上。在裝好培養基并塞好棉塞或包上8層紗布或蓋好培養容器封口膜的錐形瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線捆好，滅菌待用。當前第59頁\共有81頁\編于星期五\19點4.培養基的滅菌下一章節詳述。當前第60頁\共有81頁\編于星期五\19點5.斜面和平板的制作5.1斜面的制作將已滅菌裝有瓊脂培養基的試管，趁熱傾斜固定，凝固后即成斜面。斜面長度不超過試管長度1/2為宜。如制作半固體或固體深層培養基時，滅菌后則應垂直放置至冷凝。當前第61頁\共有81頁\編于星期五\19點葡萄糖：乳糖＝1：9下黃上不黃為分解葡萄糖，不分解乳糖上下均黃為分解葡萄糖、乳糖上下均不黃為非發酵菌中間變為黑色為產H2S當前第62頁\共有81頁\編于星期五\19點5.2平板的制作將裝在錐形瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養基融化后，冷卻至50攝氏度左右傾入無菌培養皿中。溫度過高時，皿蓋上冷凝水太多，溫度低于50攝氏度，培養基易于凝固而無法制作平板。平板的制作應在酒精燈旁進行，左手拿培養皿，右手拿錐形瓶的底部或試管，左手同時用小指和手掌將棉塞打開，灼瓶口。用左手大拇指將培養皿蓋打開一縫。置于桌上，輕輕旋轉平皿。使培養基均勻分布于整個平皿中，冷凝后即成平板。當前第63頁\共有81頁\編于星期五\19點三、實驗材料3.1藥品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、酵母膏、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO4?7H2O和FeSO4?7H2O、馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂等。當前第64頁\共有81頁\編于星期五\19點3.2溶液1mol/LNaOH、1mol/LHCl。當前第65頁\共有81頁\編于星期五\19點3.3儀器天平、高壓蒸汽滅菌器。當前第66頁\共有81頁\編于星期五\19點3.4玻璃器皿移液管、試管、量筒、錐形瓶、培養皿、玻璃漏斗等。當前第67頁\共有81頁\編于星期五\19點3.5其他常用器皿藥匙、pH試紙、稱量紙、記號筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙、報紙等。當前第68頁\共有81頁\編于星期五\19點四、實驗內容4.1肉膏蛋白胨培養基的配制培養基成分牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5g瓊脂15-20g水1000mlPh7.2當前第69頁\共有81頁\編于星期五\19點配制方法（1）稱量及融化分別稱取蛋白胨和NaCl的所需量，置于燒杯中，加入所需水量的2/3左右的蒸餾水，用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一燒杯中，進行稱量。然后加入少量蒸餾水于小燒杯中，加熱融化。倒入上述燒杯中。將燒杯置于石棉網上加熱，用玻璃棒攪拌，使藥品全部融化。當前第70頁\共有81頁\編于星期五\19點（2）調Ph待溶液冷卻至室溫時，用1mol/lNaOH溶液調pH至7.2。（3）定容將溶液倒入量筒中，補充水量至所需體積。（4）加瓊脂加入所需量的瓊脂，加熱融化，補充失水。（5）分裝、加塞、包扎。（6）高壓蒸汽滅菌0.1MPa滅菌20min。當前第71頁\共有81頁\編于星期五\19點4.2高氏合成一號培養基4.3馬鈴薯葡萄糖培養基當前第72頁\共有81頁\編于星期五\19點4.4培養基使用注意事項配制培養基所用的化學藥品，均應化學純凈。配制培養基時各種成分應準確稱量。培養基的酸堿度，必須準確測定，特別對含有指示劑的培養基；測定酸堿度須于冷卻后測定為準。制備的培養基必須保持澄清，以便細菌生長后，容易觀察。液體培養基沉淀法和濾紙法；固體培養基可用脫脂棉花濾清。當前第73頁\共有81頁\編于星期五\19點培養基使用注意事項培養基必須達到完全無菌的目的。要注意有