實驗三SDSPAGE測定蛋白質相對分子質量第一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五一、實驗目的二、實驗原理三、實驗步驟本節課的內容第二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五一、實驗目的學習SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質分子量的原理。掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術。第三頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五二、實驗原理電泳的基本知識和原理SDS的性質與作用聚丙烯酰胺凝膠的性質第四頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五什么是電泳？

電泳（electrophoresis）是指帶電顆粒在電場中的泳動。許多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都含有可電離基團，在非等電點條件下帶有電荷，在電場力的作用下，它們向著與其所帶電荷相反的電極移動。電泳技術就是利用樣品中各種分子帶電性質、分子大小、形狀等的差異，在電場中的遷移速度不同，從而對樣品進行分離、純化和鑒定的一種綜合技術。可用于樣品的制備、純度鑒定、分子量測定等。電泳的基本知識和原理第五頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五影響帶電粒子在電場中泳動的因素1．生物大分子的性質：待分離生物大分子所帶電荷的多少、分子大小和性質都會對電泳產生明顯影響。2．緩沖液：緩沖液pH值直接影響生物大分子的解離程度和帶電性質.溶液pH值距離等電點愈遠，生物大分子所帶凈電荷就越多，電泳時速度就越快。當緩沖液pH大于等電點時，生物大分子帶負電荷，電泳時向正極移動；當緩沖液pH小于等電點時，生物大分子帶正電荷，電泳時向負極移動。電泳的基本知識和原理第六頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五3．電場強度：

電場強度指每單位介質長度的電位梯度（又稱電位差或電位降）。一般而言，電場強度越大，電泳速度越快。但隨著電場強度的增大會引起通過介質的電流強度增大，從而造成電泳過程產生的熱量增多，最終導致介質溫度升高。降低電流強度，可以減少產熱，但會延長電泳時間，引起生物大分子擴散增加，同樣影響分離效果。所以電泳實驗中要選擇適當的電場強度。電泳的基本知識和原理第七頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五4．電滲：

液體在電場中對于固體支持介質的相對移動稱為電滲。由于支持介質表面存在一些帶電基團，如濾紙表面含有羧基，瓊脂含有硫酸基等。這些基團電離后使支持介質表面帶電，吸附一些帶相反電荷的離子在電場作用下向電極方向移動，形成介質表面溶液的流動。當電滲方向與電泳方向相同時則加快電泳速度；當電滲方向與電泳方向相反時，則降低電泳速度。電泳的基本知識和原理第八頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五5．支持介質的篩孔：支持介質的篩孔大小對生物大分子的電泳遷移速度有明顯的影響。在篩孔大的介質中泳動速度快，反之則泳動速度慢。電泳的基本知識和原理第九頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五電泳技術的分類1.根據電泳中是否使用支持介質分為自由電泳和區帶電泳：①自由電泳不使用支持介質，電泳在溶液中進行。②區帶電泳需使用支持介質，根據支持介質不同可分為醋酸纖維薄膜電泳、薄層電泳和凝膠電泳等。根據支持介質的裝置形式不同又可分為水平板式電泳、垂直板式電泳、垂直盤狀電泳、毛細管電脈等。2.根據電泳時電壓的高低分為高壓電泳和常壓電泳：①高壓電泳使用的電壓在500～1000V，這類電泳分離速度快，但熱效應較大，必須具備冷卻裝置，主要適用于小分子化合物的快速分離。②常壓電泳使用的電壓在500V以下，電位梯度為2～10V/cm。這類電泳的分離速度較慢，但對電泳設備要求簡單。電泳的基本知識和原理第十頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五3．根據電泳系統pH是否連續分為連續pＨ電泳和不連續pＨ電泳：①連續pH電泳是指電泳全過程中pH保持不變，②不連續pH電泳是指電極緩沖液和電泳支持介質中的pH不同，甚至電泳支持介質不同區段的pH也不相同，如聚丙烯酰胺凝膠電泳。4．根據工作目的和分離樣品的數量多少分為分析電泳和制備電泳。5．根據結合配套的技術種類不同分為免疫電泳、層析電泳、等電聚焦電泳、轉移電泳、雙相電泳、脈沖梯度電場凝膠電泳和相互垂直交替電場凝膠電泳等。6．根據電泳物質類別不同分為細胞電泳、核酸電泳、蛋白質電泳等

電泳的基本知識和原理第十一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五電泳示蹤劑電泳常用的示蹤劑有溴酚蘭和二甲苯青FF。示蹤劑一般與蔗糖、甘油組成上樣緩沖液，蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增加，以確保樣品均勻沉入加樣孔內。電泳的基本知識和原理第十二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五十二烷基磺酸鈉(SDS)

Sodiumdodecylsulphate

CH3-(CH2)10-CH2OSO3--Na+

SDS的性質與作用SDS是一種陰離子型去污劑，SDS能使蛋白質的非共價鍵（氫鍵、疏水鍵）打開，并結合到蛋白質分子上，形成蛋白質SDS復合物。第十三頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五

蛋白質變性0.1-1%SDS0.1Mbeta-巰基乙醇蛋白質變與SDS分子按比例結合1：1.4SDSSDS的性質與作用SDS的結構決定了它可破壞蛋白質的疏水作用（該作用對維持蛋白三級和四級結構相當重要），SDS：十二烷基磺酸鈉，十二烷基部分是疏水結構，而磺酸鈉部分是親水或極性結構。SDS的疏水結構可插入蛋白質的疏水內部（通常水溶性的蛋白質，其疏水氨基酸殘基埋藏在蛋白內部，親水氨基酸殘基位于分子表面），這樣，SDS就破壞了蛋白的疏水作用，從而破壞蛋白的三級或四級結構，引起變性。beta-巰基乙醇第十四頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五SDS-蛋白質復合物分子構型也幾乎相同(雪茄煙形的長橢圓棒狀的復合物)，而且具有相同的荷質比，因此在SDS中，SDS-蛋白質復合物的電泳遷移率只與其分子量有關，而不再受所帶電荷及分子形狀的影響，且在一定條件下，遷移率與分子量呈對數線性關系

SDS的性質與作用第十五頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳方法稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，具有機械強度好、彈性大、透明、化學穩定性高、無電滲作用、設備簡單、樣品量小（1～100μg）、分辨率高等優點，并可通過控制單體濃度或與交聯劑的比例聚合成不同大小孔徑的凝膠。可用于蛋白質、核酸等分子大小不同的物質的分離、定性和定量分析；還可結合解離劑十二烷基硫酸鈉（SDS）以測定蛋白質亞基的相對分子質量。聚丙烯酰胺凝膠的性質第十六頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五聚丙烯酰胺凝膠性質聚丙烯酰胺凝膠(PAG)是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑的作用下，聚合交聯而成的。聚丙烯酰胺凝膠的性質第十七頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五聚丙烯酰胺凝膠的聚合體系有兩種：（1）化學聚合：通常采用過硫酸銨(AP)為催化劑，四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在TEMED催化下，過硫酸銨可使丙烯酰胺單體的雙鍵打開、活化形成自由基丙烯酰胺，從而引發聚合作用。（2）光聚合：通常采用核黃素作催化劑，核黃素在光照下光解成無色基，后者再被氧化成自由基而引發聚合作用。光聚合的凝膠孔徑較大，而且隨時間延長而逐漸變小，不太穩定。化學聚合的凝膠孔徑較小，且各次制備的重復性好。故一般采用化學聚合。聚丙烯酰胺凝膠的性質第十八頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳有三種效應：濃縮效應、電荷效應和分子篩效應。濃縮效應在濃縮膠中進行；電荷效應和分子篩效應在分離膠中進行。蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。聚丙烯酰胺凝膠的性質第十九頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五三、實驗步驟一、安裝垂直板型電泳裝置二、凝膠的制備

第二十頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五分離膠的制備在一個干凈的小燒杯中，按所列的試劑用量配制。

SDS-不連續系統12％分離膠濃度，10ml體積配制量：1.30%凝膠貯液4.0ml2.分離膠緩沖液1.25ml3.10%SDS0.1ml4.ddH2O4.0ml5.10%過硫酸胺0.06ml6.2%TEMED0.6ml第二十一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五加入分離膠溶液pH8.8封水或飽和乙醇溶液出現明顯界面時，分離膠凝聚完成（３０min~１h）倒出水或乙醇，并用濾紙吸干制備分離膠封水的目的是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。第二十二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五濃縮膠的制備在另一個干凈的小燒杯中。

4.5％分離膠濃度，5ml體積配制用量表：1.30%凝膠貯液0.75mL2.濃縮膠緩沖液0.83mL3.10%SDS

0.1ml4.ddH2O3.0mL10%過硫酸胺0.03mL2%TEMED

0.3mL第二十三頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五分離膠pH8.8加入濃縮膠溶液pH6.8制備濃縮膠樣梳需一次平穩插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。插入樣品梳第二十四頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五濃縮膠對蛋白樣品具有壓縮堆積作用。凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區帶。當樣品液和濃縮膠選pH6.8的TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導區，而電場強度與低電導區成反比，因而產生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。大大提高了電泳的靈敏度。濃縮膠的工作原理：第二十五頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五牛血清白蛋白樣品2樣品1蛋白marker樣品1樣品2牛血清白蛋白兩塊膠一個電泳系統，兩組共用：第一組加樣第二組加樣第二塊膠加樣順序與第一塊膠相同第二十六頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五三加樣

將pH8.3的電極緩沖溶液倒入上、下貯槽中，應沒過短玻璃片。用微量注射器依次在各個樣品凹槽內加樣，一般加樣體積為10～15μL。如樣品較稀，可加20～30μL。由于樣品溶解液中含有比重較大的甘油，故樣品溶液會自動沉降在凝膠表面形成樣品層。第二十七頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五四電泳

將上槽接負極，下槽接正極，打開電源，開始時將電流控制在15～20mA,待樣品進入分離膠后，改為30～50mA。待藍色染料遷移至下端約1～1.5cm時，停止電泳，約需1～2小時。恒壓(60V90V)

第二十八頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五1.加入電極緩沖液pH8.3濃縮膠pH6.83.通電分離膠pH8.82加入樣品上樣及電泳開始電流恒定在10mA，當進入分離膠后改為20mA，溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。第二十九頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五五剝膠

取下凝膠模子，將凝膠片取出，滑入一白瓷盤或大培養皿內。第三十頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五六染色和脫色

染色用一塊膠，另一塊膠用于轉膜。加入染色液，染色45分鐘。脫色

染色完畢，傾出染色液，加入脫色液。20～30min換一次脫色液，2～3次后可初步觀察電泳條帶，然后脫色過夜，直至背景清晰。第三十一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五七、Mr的計算

標難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性。

以每個蛋白標準的分子量對數對它的相對遷移率作圖得標準曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量。

第三十二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期五八轉膜膠放在3張緩沖液浸濕的濾紙上