淺論人端粒酶啟動子（hTERTp）真核表達載體的構建【摘要】目的克隆人端粒酶催化亞單位(hTERT)的啟動子，構建真核表達載體pEGFP-hTERT。方法以人類基因組DNA為模板，應用PCR方法擴增hTERT上游序列長約1135bp的啟動子片段，克隆入綠色熒光蛋白GFP的基因上游，測序鑒定。結果DNA測序結果與GenBank中hTERT啟動子DNA序列完全一致，片段長度為1135bp。結論人端粒酶啟動子的真核表達載體pEGFP-hTERT構建成功，為hTERTp調控元件用于腫瘤靶向性基因治療奠定了基礎。

【關鍵詞】端粒酶啟動子；熒光蛋白；腫瘤

Abstract：ObjectiveTocloneDNAsequenceofhumantelomerasereversetranscriptasepromoter(hTERTp),andtoconstructeukaryoticexpressionplasmidofpEGFP-hTERT.Methods1135bphTERTpromoterwereamplifiedwithpolymerasechainreaction(PCR)method,utilizinghumangenomeastemplate.ThehTERTpromoterwasinsertedintopEGFPtoreconstructarecombinantplasmidnamedpEGFP-hTERTp,andthesequencewasdetected.ResultsDNAsequencingshowedasamesequenceasregisteredinGeneBank.Thesequencecontained1135bp.ConclusionsTheconstructionandtheexpressionofeukaryoticplasmidpEGFP-hTERTphavebeenachievedsuccessfully.TheresearchpavedthewayfortumorgenetherapyofregulatoryelementsofhTERTp.

Keywords:hTERTp;GFP;cancer

端粒酶由RNA和蛋白質兩部分組成。以自身RNA為模板合成端粒酶重復序列，具有逆轉錄酶活性，它的活性不依賴于DNA聚合酶，對RNA酶、蛋白酶和高溫均敏感。端粒酶活性表達能穩(wěn)定端粒的長度，抑制細胞的衰老，在生殖細胞和干細胞中可檢測到高水平的端粒酶活性。端粒酶具有使腫瘤細胞系持續(xù)復制生存的特點，成為近期生命科學界關心與研究的一個熱點。端粒缺陷的染色體不穩(wěn)定性使其通過促進半合子化、轉位、擴增及重組裝而加速腫瘤進程。端粒磨耗的最終結果是端粒酶的活化，以彌補端粒的丟失而使細胞無限增殖，成為永生細胞。端粒酶活化使腫瘤進入晚期，而啟動子的激活是細胞永生的關鍵一步，因此端粒酶的啟動子(humantelomerasereversetranscriptasepromoter,hTERTp)已經逐漸成為學者們研究的焦點。本實驗中，我們采用PCR方法克隆了hTERTp的DNA序列,并將其替換綠色熒光蛋白質粒pEGFP-N1上游的啟動子,以便為研究以hTERTp為靶點的腫瘤靶向性基因治療奠定基礎。

1材料和方法

細菌和質粒大腸桿菌DH5α購買于Takara公司；熒光蛋白質粒pEGFP-N1購買于Promega公司。

主要試劑和實驗設備DMEM培養(yǎng)基為GIBCO公司產品;質粒小量提取純化試盒、kbMarker、PCR產物純化試劑盒為北京威格拉斯技術有限公司產品；PCR引物由大連寶生物有限公司合成；限制性內切酶AseⅠ、BamHⅠ、Taq聚合酶、DNA連接試劑盒DNALigationKitVer.為TaKaRa公司產品；LipofectamineTM2000、Trizol購買于Invitrogen公司；主要實驗設備有:Biometrapersonal公司生產的PX2型96孔PCR擴增儀,Bio-RAD公司生產的PCA300型電泳儀。

主要試驗步驟

hTERTp的PCR擴增及鑒定根據GenBank中hTERT序列設計兩對引物。DLM1：上游引物5‘-GCACCCATAATACTGGGGTGTCTTC-3‘,下游引物5‘-CGCGCTCGCACAGCCTCTG--3‘；DLM2：上游引物:5‘-TAATTAATCTGTCCTGCGGTTGTGCCGG-3‘下游引物:5‘-CGGGATCCGAGCGCACGGCTCGGCAG-3‘；DLM2引物5‘端分別引入限制性內切酶AseⅠ、BamHⅠ的酶切位點(下劃線表示)。先以基因組為模板，以DLM1為引物，退火℃進行PCR反應，擴增產物為2068bp；再以第一次PCR產物為模板，以DLM2為引物,退火66℃進行PCR反應，擴增目的片段為1135bp。PCR產物用%瓊脂糖凝膠(TAE緩沖液配制)電泳,并用PCR產物回收試劑盒回收純化［1］。

pEGFP-hTERTp重組質粒的構建用AseⅠ和BamHⅠ雙酶切帶酶切位點的PCR產物，用PCR產物純化試劑盒回收約1135bp的DNA條帶；用AseⅠ和BamHⅠ雙酶切pEGFP-N1質粒，酶切產物用%瓊脂糖凝膠電泳回收；上述兩種回收產物按質量比為4∶1作連接反應，采用LigationKitDNA連接試劑盒，16℃過夜。將連接反應液轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布于含50mg/L卡那青霉素的LB瓊脂板，倒置于37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)，次日挑單菌落，接種于10mL含50mg/L卡那青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取5mL菌液，用質粒純化試劑盒制備少量質粒，用AseⅠ和BamHⅠ雙酶切和PCR兩種方法鑒定，并取含pEGFP-hTERTp的菌液1mL送上海生工做DNA序列分析。

田力，等：人端粒酶啟動子真核表達載體的構建遼寧醫(yī)學院學報2008年12月，29(6)

2結果

PCR產物電泳結果以人類基因組為模板,PCR擴增hTERTp，經%瓊脂糖凝膠電泳，得到清晰的1135bp大小的DNA片段(圖1)，與預期結果吻合。M：Marker1：PCR產物

真核表達載體的鑒定PCR產物或酶切產物分別取5μL與6×LoadingBuffer1μL混勻上樣，進行%瓊脂糖凝膠電泳。

PCR鑒定以pEGFP-hTERTp質粒為模板的PCR產物預期產生1135bp條帶，而電泳結果與預期相符，見圖2。

酶切鑒定pEGFP-hTERTp經AseⅠ和BamHⅠ雙酶切預期產生1135bp和3986bp兩條帶，見圖3，說明該質粒經酶切鑒定正確。M：Marker1：質粒PCR結果

測序鑒定構建的hTERTp序列與hTERTp原始序列(AF098956)進行比對，測序結果說明表達載體構建成功。

3討論

GFP是從水母中分離出來的一種發(fā)光蛋白，它可在450～490nm的藍光激發(fā)下發(fā)出綠光。而GFP作為一種基因表達的標記物其優(yōu)點在于：攜帶GFP的融合蛋白既具有GFP的綠色熒光，又保持靶蛋白的生理功能，而且對細胞無毒性作用；將GFP融合基因轉染至真核細胞中表達后，分析已知或未知基因表達蛋白在細胞中的分布和定位。因此，GFP作為一種極具有潛力的標記物為研究基因功能及表達調控提供了極大的便利。

端粒酶(telomerase)是一種RNA依賴的DNA多聚酶，其功能是以自身的RNA為模板，合成位于染色體末端的一段富含5′-TTAGGG-3′的特殊DNA序列,即端粒，補償細胞分裂過程中端粒的丟失，使細胞得以無限分裂。端粒酶激活是細胞獲得永生化和惡性變的重要機制。有研究顯示，端粒酶在85%以上的腫瘤細胞中呈現(xiàn)陽性表達，而在幾乎所有的正常人體細胞中無活性。這一現(xiàn)象提示，hTERT基因表達的調控是端粒酶活性調控的中心環(huán)節(jié)，hTERTp在腫瘤細胞中的特異性轉錄使人們意識到hTERTp在腫瘤細胞中的激活也是腫瘤發(fā)生的關鍵因素。研究表明，轉錄起始位點位于hTERTcDNA首位核苷酸上游-19bp，在hTERTp區(qū)域沒有TATA盒和CAAT盒，但是包含轉錄起始元件CCTCTCC，因此，稱轉錄起始位點上游180～208bp為核心啟動子區(qū)，神經酰胺能夠阻斷該核心區(qū)，而抑制hTERTp的功能［2］。但是，hTERTp具體哪一部分序列是啟動基因轉錄的必需元件目前還在探索中。

近年來，一些學者在這方面作了一些探索。李帆等人通過PCR的方法獲得了335bp長度的啟動子，并證明它能夠啟動LacZ基因的表達［3］。王艷等人通過人工合成的方法獲得了258bphTERTp，啟動了黑色素瘤分化相關基因-7的表達［4］。采用PCR方法克隆了長度為1135bp的hTERTp片段，位于轉錄起始位點上游1135bp到起始密碼子之間，我們將克隆的hTERTp插入到綠色熒光蛋白GFP基因上游，PCR結果與測序結果均證明重組質粒pEGFP-hTERTp構建成功。下一步我們將通過PCR的方法利用已經構建成功的重組質粒pEGFP-hTERTp獲得250bp、500bp、800bp、1135bp等不同長度的啟動子再插入到綠色熒光蛋白GFP基因上游，觀察它們是否具有啟動綠色熒光蛋白GFP基因表達的活性，確定hTERTp的具體啟動必需序列的位置，從而為調控hTERTp在腫瘤細胞中的表達的研究奠定基礎。應用hTERTp驅動腫瘤相關因子凋亡或表達增強，可以獲得對癌細胞生長明顯的抑制和誘導凋亡的作用［5］，也為研究hTERTp功能和為臨床基因治療腫瘤提供了新的思路。

【參考文獻】

［1］SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.分子克隆實驗指南［M］.北京:科學出版社,1996:486-491.

［2］LeslieGWooten-Blanks,PengfeiSong,CanESenkal，etofceramide-mediatedrepressionofthehumantelomerasereversetranscriptasepromoterviadeacetylationofSp3byhistonedeacetylase1［J］.20