基因工程第二章基因克隆所需的工具酶第一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新天然DNA的來源染色體DNA、病毒和噬菌體DNA、質粒DNA、線粒體和葉綠體DNA天然DNA的提取準備生物材料裂解細胞分離和抽提DNA第二節天然DNA的制備第二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新限制性核酸內切酶（restrictionendonuclease）是一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列．并使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開的內脫氧核糖核酸酶一

.限制性內切酶的發現

1.

細菌限制修飾系統的發現

WernerArber于1962-1968年發現，1968年分離到I型限制酶。

2.限制酶HindII的發現

H．O．Smith和Wilox于1970年首次從流感嗜血桿菌（H.influenzae）中發現并分離到HindII限制酶。

3.SV40限制圖譜和轉錄圖譜的繪制

D.Nathans（1971年）用HindII繪制SV40的限制酶譜。第三節限制性核酸內切酶和DNA片斷化第三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新1.

I型：由三個基因構成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色體上，三個基因構成一個復合體，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。2.

II型：限制與修飾基因產物獨立起作用，在Ｅ.coli中這兩種基因位于質粒上。3.

III型：修飾酶與Ｉ型酶相同，hsdＭ與hsdＳ基因產物結合成一亞單位，限制酶是獨立存在的。上述三個系統中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。

二、限制修飾系統的種類第四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新1.定義：廣義指上述三個系統中的限制酶；狹義指II型限制酶。

2.命名：限制酶由三部分構成，即細菌種屬名、菌系編號、分離順序。例如：HindⅢ前三個字母來自于菌種名稱H.influenzae，“ｄ”表示菌系為ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分離到的第三個限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—Haemophilus

influensaedⅢSacI(II)—Streptomyces

achromagenesI(Ⅱ)三.限制性內切酶的定義、命名第五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新1.識別順序和酶切位點１）識別４-8個相連的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC；PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；

SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGGFokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’

外側，產生５’-端突起２）富含ＧＣ四．限制酶的特點第六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新３）對稱性—雙對稱

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

４）切點大多數在識別順序之內，也有例外５）限制酶切后產生兩個末端，末端結構是５’-Ｐ和３’-ＯＨ

2.

末端種類１）３’-端突起，個數為２或４個核苷酸

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

２）５’-端突起，個數為２或４個核苷酸

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAPHOG-5’四．限制酶的特點第七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新３）

平齊末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

４）非互補的粘性末端ａ）切點在識別順序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13

ｂ）能識別簡并順序的，如：AvaI

AvaI5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG四．限制酶的特點第八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新

1.定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶

2.特點：1）識別相同順序

2）切割位點的異同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG五.異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）第九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新6、限制性內切酶的星號活性在某些反應條件下，限制酶識別順序的特異性可能發生變化，結果一種限制酶酶切同一種DNA片斷會產生新的酶切位點，得到不同的酶切片斷，這就是限制酶的星號活性（staractivity）EcoR1GAATTC----AATT第十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新6、限制性內切酶的星號活性引起星號活性的可能因素甘油濃度過高離子強度不合適陽離子的變化溶液中PH值的變化在基因工程操作中，應避免星號反應的出現第十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新二、限制酶的使用方法用限制酶消化DNA（酶切）是基因工程最基本的實驗技術最常用的消化條件：反應體積：20ul10xBuffer：2ulDNA濃度：0.5—1.0ul第十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新二、限制酶的使用方法1、影響限制酶消化DNA的若干因素DNA的純度的影響DNA濃度的影響酶濃度的影響酶反應條件的影響雙酶消化第十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新影響限制酶消化DNA的若干因素DNA的純度的影響限制酶作用于純度不高的DNA時，會進行不完全酶解（部分酶切）RNA或其他DNA的污染影響小蛋白質污染并與DNA結合后，可能降低或終止酶切反應解決辦法：用酚和氯仿抽提除去蛋白質第十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新影響限制酶消化DNA的若干因素DNA的濃度的影響DNA濃度過高帶進更多的雜酶和雜質如限制酶量不足，可能引起部分酶切底物濃度過高，可能引起底物抑制第十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新影響限制酶消化DNA的若干因素酶濃度的影響1酶單位：是指在最適條件下完全消化1ugdsDNA所需要的酶量

用酶量過多，帶進的雜質愈多，有可能增加Dnase1的危險酶切設計時，甘油濃度不要超過5％第十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新影響限制酶消化DNA的若干因素酶反應條件的影響一般酶的反應條件：溫度：37℃PH：7.2時間：2小時DNA酶切反應（控制反應時間）完全消化部分消化第十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新影響限制酶消化DNA的若干因素雙酶消化反應條件相同：同時加到反應管，同時反應對溫度要求不同：先低溫消化，再高溫消化對鹽濃度要求不同：先低鹽酶消化，再高鹽酶消化第十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新二、限制酶的使用方法2、單一限制酶酶切位點的創立利用甲基化酶的修飾作用改變酶的識別序列，創造新的識別位點消除反應：某一種限制酶存在兩種識別序列，如將其中一個序列中的某個堿基甲基化，使其不能被限制酶識別，從而使另一序列成為單一酶切位點鄰近反應：與限制酶識別序列鄰近的堿基有時作為某個甲基化酶的識別序列，而使其不再被限制酶所識別如BamH1：GGATCC>GGATCCGG第十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新構建DNA的物理圖譜DNA物理圖譜：標明限制性內切酶在DNA分子上的限制位點數目、限制片段大小及其排列順序的圖譜。又稱限制性圖譜。構建物理圖譜的常用方法部分消化法雙酶消化法第二十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新構建DNA的物理圖譜構建物理圖譜的常用方法部分消化法基本原理：首先以某個酶對DNA進行完全消化，再進行部分消化：

部分消化的DNA大片段必定等于完全消化中相應部位的2個以上小片段之和。根據兩類消化中片段大小的關系和交錯重疊現象．找出各片段的鄰近位置，排出它們的順序。

第二十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新某限制酶在一線型DNA分子上有三個切點：完全消化：A,B,C,D部分消化：BC,AD,ABC,D,ACD,B,AC,A,C推測其物理圖譜。提示：從部分消化的結果中排除與完全消化相同的單一片段，然后根據剩余片段，推測其物理圖譜從部分消化的結果中排除與完全消化相同的單一片段剩余：BC,AD,ABC,ACD,AC推測其物理圖譜為：BCAD第二十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新從細菌中分離了一個18.1Kb的線形DNA，用AvaⅡ完全消化得到8個片段，部分消化產生14個片段，求其物理圖譜。完全消化片段：A(4.6),B(4.0),C(3.3),D(2.5),E(2.0),F(1.0),G(0.5),H(0.2)從部分消化的結果中排除與完全消化相同的單一片段剩余：6.6，6.5，5.3，4.2，3.8，3.5，0.7部分消化片段：6.6，6.5，5.3，4.6，4.2，4.0，3.8，3.5，3.3，2.5，1.0，0.7，0.5，0.2第二十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新構建DNA的物理圖譜構建物理圖譜的常用方法雙酶消化法兩個限制性內切酶先分別單獨消化DNA的基礎上，然后再同時或先后消化此DNA基本原理：單酶消化時的某些片段在雙酶消化時可能仍然保留，另一些片斷可能消失而出現新的片段，說明一個酶的切點可能正好在另一個酶的片段之內。那么，新出現的2或3個片段的分子量之和必然等于那個消失的大片段：根據片段的大小找出消失片段與新生片段的關系，通過它們的交錯重疊現象．確定各片段間的鄰近位置，組建出此DNA的物理圖譜。

第二十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新用雙酶消化法組建某線型DNA的物理圖譜用甲酶單獨消化產生兩個片段a,b用乙酶單獨消化得到三個片段A,B,C用甲酶、乙酶混合消化得到四個片段：A,1,2,C試分析其相互關系。ab甲酶ABC乙酶A12C乙酶乙酶甲酶第二十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新從大腸桿菌分離到一個質粒DNA，用EcoRI，HincⅡ，HpaI，SmaI進行單一和雙酶消化，組建它們的物理圖譜

第二十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新

根據片段的大小，將每一對酶的結果分別清理，除去在單酶和雙酶消化時共同產生的片段，再按照分子量大小，找出新生小片段和一個消失大片段之間的關系

第二十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新第四節其他工具酶一、E.coliDNA聚合酶（DNApolⅠ）E.coli

的DNA聚合酶系統PolI參與DNA修復,具3’→5’和5’→3’外切酶活性polII同上具3’→5’外切酶活性polIII參與DNA復制,具3’→5’和5’→3’外切酶活性E.colipolI的特點具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦稱為Klenow片段,polIK)聚合酶活性，5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延續性受反應條件的影響（表6）外切酶活性第二十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新一、E.coliDNA聚合酶（DNApolⅠ）5’-->3’聚合酶活性催化單核甘酸結合到DNA模板的3‘－OH末端5‘CCGOHDNApolⅠ5’CCGATAGCCTGGCTATCGGA

Mg2+GGCTATCGGA第二十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新一、E.coliDNA聚合酶（DNApolⅠ）3’-->5’外切酶活性從游離的3‘－OH末端降解dsDNA成為單核甘酸，但是它解離掉的部分主要是未配對的ssDNA.(其對dsDNA的外切活性可被5’3‘多聚活性所抑制)5‘CCGTATCGGAOHDNApol15’CCGGGCMg2+GGC第三十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新一、E.coliDNA聚合酶（DNApolⅠ）5’-->3’外切酶活性從5‘末端降解dsDNA成為單核甘酸，

5‘

GATAGCCTDNApol15’

TAGCCT3’GGCTATCGGAMg2+3’GGCTATCGGA第三十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新E.coliDNApolⅠ在基因工程中的作用制備高比活的DNA探針（采用缺口平移技術）用于分子克隆DNA序列分析第三十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新二、DNA聚合酶Ⅰ大片斷（Klenow酶）5’-->3’聚合酶活性催化單核甘酸結合到DNA模板的3‘－OH末端5‘CCGOHDNApol15’CCGATAGCCTGGCTATCGGA

Mg2+GGCTATCGGA第三十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新二、DNA聚合酶Ⅰ大片斷（Klenow酶）3’-->5’外切酶活性作用底物主要是ssDNA.(其對dsDNA的外切活性由于受到聚合酶作用的阻礙大大降低)第三十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新二、DNA聚合酶Ⅰ大片斷（Klenow酶）在基因工程中的作用用同位素標記DNA片斷的3‘末端

當DNA經限制酶酶切產生5‘端伸出的末端時，可用Klenow酶催化，在3’端標記上與5‘端伸出的堿基順序互補的核甘酸，在此反應中應用的同位素必須是α－32P-dNTP第三十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新CTTAA5’Gα－32P-dATPCTTAA5’GA*A*Klenow酶CTTAA5’Gα－32P-dATPα－32P-dTTPCTTAA5’GA*A*T*T*

Klenow酶第三十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新二、DNA聚合酶Ⅰ大片斷（Klenow酶）在基因工程中的作用用同位素標記DNA片斷的3‘末端用Klenow酶可將5‘端伸出的末端填平為平末端在反向轉錄合成cDNA的實驗中，用Klenow酶合成雙鏈cDNA,除去3‘端的單鏈末端

第三十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新三、T4DNA連接酶缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'ds-DNA結構:切口,缺口,斷口第三十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新三、T4DNA連接酶1.特點：只連接ds-DNA分子，要求3’-羥基和5’-磷酸基

2.用途：

1)

相同或相容粘性末端的連接

2)平整末端的相連

DNA平端來源：限制酶作用結果;限制酶與其它酶共同作用結果。平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多3.抑制劑：

PO43->5mM,NaCl>25mM,Ca++>0.1mM第三十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新5’-AAGCTT-3’5’-AOH

PAGCTT-3’PAGCTTAOH3’-TTCGAA-5’3’-TTCGAP

HOA-5’HOATTCGAP

退火

5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’

或

5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’

T4DNA連接酶

5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’

或

5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’T4DNA連接酶的連接反應(兩種插入方向)

+第四十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新四、逆轉錄酶(依賴RNA的DNA聚合酶)

一種有效轉錄RNA成為DNA的酶，產物為cDNA,（互補DNA）由兩種亞基組成，帶有聚合酶活性和外切酶活性。聚合酶作用以RNA和DNA為模板，合成DNA

mRNA－cDNA，

sscDNAdscDNA.第四十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新四、逆轉錄酶(依賴RNA的DNA聚合酶)3‘外切核酸酶作用（RNaseH）從DNA.RNA的雜交鏈中特異性地降解RNA鏈，進而保留新合成的DNA鏈在基因工程中的作用用mRNA為模板合成單鏈cDNA，或以單鏈cDNA合成雙鏈cDNA（制備cDNA庫的常用方法）制備各種分子雜交的探針，用于檢測DNA或RNA第四十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新五、核酸酶SI（單鏈特異的核酸酶）降解ssDNA或ssRNA形成5‘－磷酸末端的單核甘酸或寡核甘酸片斷。在基因工程中的作用證明基因內部的間隔順序在cDNA合成中切開cDNA雙鏈的發夾構建新的質粒使用注意事項

1)避免長時間反應，因最適酸性pH將導致DNA斷裂或降解

2)避免使用高濃度酶量，以免DNA被降解(因產生切口)第四十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生物系葉亞新六、甲基化酶一.甲基化酶的種類與識別順序

1.

限制修飾系統I、II、III型中的甲基化酶三個系統中的甲基化酶可使細菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：在DNA重組實驗中，常用的甲基化酶屬于II型，它與相應的限制酶的識別順序相同，其甲基化位點與限制酶作用位點可同可不同。如：M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同

M．HpaICmCGGHpaICCGG相同第四十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期五2023/5/26蘇州科技學院生