探討骨髓間質(zhì)干細胞與心臟病的治療

摘要：心血管疾病導(dǎo)致的心功能障礙廣泛分布并為成人發(fā)病率和死亡率增加的重要因素。一般認為，機體缺少心肌修復(fù)和再生的有效的內(nèi)在機制，心肌細胞無增殖分化能力，受損后不能再生，只能由成纖維細胞填充，最終為瘢痕組織替代，并逐步發(fā)生心室重構(gòu)形成慢性心力衰竭。傳統(tǒng)的藥物、介入治療等雖然保護了心功能，患者生活質(zhì)量亦提高，但并不能從根本上逆轉(zhuǎn)心血管疾病引起的心肌細胞數(shù)量減少；心臟移植則由于供體來源少、風(fēng)險大、排斥反應(yīng)等難以廣泛開展。干細胞移植有可能取代受損心肌細胞，增加有功能的心肌細胞數(shù)量，并建立新的血管來供應(yīng)血運，為心肌梗死的治療開辟了一條新途徑。骨髓間質(zhì)干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcell，BMSC)是存在于骨髓中的非造血干細胞，具有來源廣、取材方便、免疫原性低、易于分離和體外培養(yǎng)擴增、易于外源基因的導(dǎo)入和表達、可進行基因修飾、能分化為心肌細胞和內(nèi)皮細胞等優(yōu)勢，成為心血管疾病細胞移植治療的理想種子細胞。

關(guān)鍵詞：心血管疾病

1BMSC向心血管組織細胞分化

大量實驗數(shù)據(jù)表明，BMSC一旦暴露于多種生理或非生理性刺激下，進一步分化的細胞顯示心肌樣細胞的幾種特征。在這些條件下，體外分化的BMSC顯示出肌管樣結(jié)構(gòu)和時間依賴性同步跳動特性；電子顯微鏡分析揭示這些細胞具有心肌細胞樣超微結(jié)構(gòu)包括典型的肌小節(jié)，中心位核和心房顆粒；并呈現(xiàn)發(fā)育心肌細胞的幾種功能特征包括肽類物質(zhì)的產(chǎn)生、多重結(jié)構(gòu)收縮性蛋白的表達；它們也顯示出至少具有竇房結(jié)樣和心室樣細胞興奮能力[1-3]。

已明確介質(zhì)和直接的細胞與細胞之間的接觸均可誘導(dǎo)BMSC分化為心肌細胞。通過與人類心肌細胞共培養(yǎng)，已經(jīng)證實干細胞可以獲得心肌細胞樣的表型特征為表達重鏈肌球蛋白、βactin及肌鈣蛋白T。然而，當(dāng)BMSC在心肌細胞條件培養(yǎng)基下培養(yǎng)時，僅能觀察到βactin表達。因此，細胞與細胞之間的直接接觸對于促使BMSC分化為心肌細胞基因譜系的心肌環(huán)境或微環(huán)境的信號傳遞是必須的。而且，人BMSC呈現(xiàn)出細胞與細胞之間的相互偶聯(lián)并通過特殊的縫隙連接與心室肌細胞偶聯(lián)[4，5]。實驗觀察到培養(yǎng)的心房和心室肌心肌細胞與從BMSC分化而來的心肌細胞樣細胞具有驚人的細胞及分子相似性，為更好地理解原始成體細胞和BMSC源性心肌細胞之間的細胞對話邁出了重要的一步。已證實BMSC不僅可分化為心肌細胞，同時還可以分化為血管平滑肌細胞或其前提細胞、祖細胞和內(nèi)皮細胞。這些細胞類型均與血管系統(tǒng)發(fā)生有關(guān)，包括血管的生成和擴張。研究表明，新vSMC/PC形成出現(xiàn)在血管周圍間質(zhì)干細胞分化后，呈現(xiàn)血小板源性生長因子B(PDGFB)依賴性過程；隨后又發(fā)現(xiàn),在心肌內(nèi)注射BMSC后，組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)分析揭示注入的細胞分化為心肌細胞、vSMC/PC和內(nèi)皮細胞，同時可觀察到血管密度的增加。與此相似，給慢性缺血的狗心肌內(nèi)注射BMSC可產(chǎn)生血管供應(yīng)增加的效應(yīng)并改善心功能。免疫熒光分析揭示，內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞出現(xiàn)共區(qū)域化，與肌細胞卻不存在共區(qū)域。因此，這些數(shù)據(jù)表明BMSC成為心梗后病人大量心血管組織細胞成分的一個理想的供體來源。BMSC分化為心肌細胞繼發(fā)新生血管形成和心功能改善的機制與BMSC引起的生長因子的旁分泌有關(guān)[8-10]。已經(jīng)證實，F(xiàn)GF2，一種主要的有絲分裂蛋白，是由BMSC產(chǎn)生，并分別刺激定型和未定型的BMSC持續(xù)休眠和增值[11]。未定型的BMSC代表休眠前體的少數(shù)細胞群，而定型和成熟的BMSC產(chǎn)生大量的終末分化的間質(zhì)細胞系[12]。

以上闡述BMSC具有分化為幾種心臟表型細胞的潛能，多數(shù)情況是根據(jù)冰凍組織樣本的免疫組織學(xué)分析顯示固定細胞的細胞系的特殊細胞標(biāo)志的共區(qū)域化的實驗依據(jù)為基礎(chǔ)。到目前為止，還沒有證實BMSC注入后在受體心臟檢測到的已明確的免疫表型是肌原性和血管細胞系分化的真正顯示且不是假象。在骨髓干細胞可塑性研究方法學(xué)進一步發(fā)展后，相似的觀點已引起廣泛爭議。因此，目前有必要借助一種合適的可確保實驗結(jié)果準(zhǔn)確、可重復(fù)及穩(wěn)定的方法學(xué)檢測進行BMSC分化為心肌細胞的研究。此將有助于避免不必要的爭議諸如骨髓造血干細胞橫向分化為心臟表型細胞繼而影響心肌再生[13，14]。

2臨床前研究

嚙齒動物如羊、狗、豬或猴梗死模型的實驗研究表明，多種類型細胞進行心臟移植是可行的且有助于改善梗死心肌的收縮功能[15]。這些細胞類型包括自體同源的未純化的骨髓、骨髓單核細胞、純化的骨髓來源的細胞(CD34+和CD113+)、心肌細胞、成纖維細胞和肌原細胞。雖然可以變更移植方法、移植細胞的數(shù)量和受體的心臟狀態(tài)，但移植后的免疫或毒性反應(yīng)仍然不能檢測。

BMSC也已被認為是心臟疾病細胞治療的潛在的備選細胞。BMSC移植的有效效應(yīng)取決于它們具有呈時間依賴性和特殊的組織親和性的方式植入受體組織。由于心臟組織是BMSC最先的目的地，因而提出BMSC注入可能在心梗后重塑、血管發(fā)生及瘢痕形成的病理生理過程中起很重要的作用。關(guān)于這一點,臨床前研究數(shù)據(jù)證實冠狀動脈內(nèi)或心肌內(nèi)注入后，移植的BMSC繼續(xù)存在于心肌內(nèi)并經(jīng)過微環(huán)境依賴性的心肌基因型分化；移植入的細胞顯示心肌細胞表面標(biāo)志物的重新表達，諸如β肌球蛋白重鏈、α肌動蛋白、心臟肌鈣蛋白T和受磷蛋白。而且，移植細胞發(fā)育為含紋狀肌原纖維肌球蛋白重鏈的肌纖維及細胞與細胞之間的結(jié)點[16，17]。

由于豬和人的心臟解剖結(jié)構(gòu)相似，因而用作MI和全身心血管疾病研究的模型。應(yīng)用此模型,可以獲取到注入的BMSC進入正常和梗死的心肌組織的軌跡和短暫及長期移植的心臟效應(yīng)的有價值的信息。借助于磁共振熒光透視檢查技術(shù)，研究者們已經(jīng)確定梗死和正常組織界限的標(biāo)志性區(qū)域，指導(dǎo)心肌內(nèi)BMSC注射。除此以外，正常和梗死的心肌組織內(nèi)注入的鐵熒光粒子標(biāo)記的BMSC在移植后跳動心臟已獲許檢測[18，19]。應(yīng)用豬的這種模型，已確定心肌內(nèi)移植后2周標(biāo)記的BMSC的有效移植已經(jīng)出現(xiàn)并伴幾種肌特殊蛋白的共表達。這種現(xiàn)象意味著BMSC隨之分化為心肌樣細胞，2周后伴隨收縮功能不良的顯著緩解，同時，心肌壁變薄顯著減輕。在心肌重塑期間，一個重要的問題是與細胞再生安全可行的程序的優(yōu)化有關(guān)。應(yīng)用大動物模型，大多數(shù)研究者證明心肌內(nèi)注入祖細胞到梗死區(qū)域是安全和可行的。在豬模型上進行的有關(guān)BMSC的實驗，心肌內(nèi)注入細胞被證實是安全的而且沒有檢測到免疫和其他的毒性反應(yīng)[18，19]。心肌內(nèi)注入BMSC操作的安全性的進一步證據(jù)在犬慢性缺血模型上得到證實。證實犬接受心肌內(nèi)注入BMSC(總細胞數(shù)為1

×108)存活階段無并發(fā)癥且未顯示心率失常、心臟STT波變化或Q波起始變化等體征。而且，由于心肌激酶(CK)MB和肌鈣蛋白I水平在最初的輕度上升后又下降到基礎(chǔ)水平，心肌損害亦可除外，組織病理學(xué)分析也顯示無MI存在。然而，心肌內(nèi)注入BMSC的安全性已經(jīng)受到挑戰(zhàn)。最近的研究揭示正常犬冠脈動脈內(nèi)注入犬BMSC(10×106)后出現(xiàn)急性心肌缺血和亞急性心肌微梗死[20]；這些進一步的心臟變化發(fā)生的原發(fā)損害是由于大量(18～20μl)BMSC引起的血管阻塞導(dǎo)致的缺血狀態(tài)所致。由于此項頗有影響的研究不包括插入導(dǎo)管但未接受細胞移植的對照組犬，因而很難確定是細胞大小、導(dǎo)管插入術(shù)本身還是其他因素[21]是引起心肌缺血和微梗死的器質(zhì)性始動因素。有關(guān)冠狀動脈內(nèi)注入干細胞的安全性和有效性，Wollert’s研究結(jié)果則得出與成長期個體包括人體研究相反的結(jié)論[22]。

這些臨床前試驗在MI病人上可能產(chǎn)生的影響難以估計。從操作安全性看，任何人均可假定在豬身上進行的研究所獲得的安全性數(shù)據(jù)都可能與人相關(guān)。然而，毫無疑問的是，有必要進行更多的研究[23]。從功效看，結(jié)果顯示BMSC時間依賴性的貯留、移植、遷移和分化，強化了MSC移植是缺血性心力衰竭的一種替代治療的觀念。

3臨床研究

近幾年，開始了幾項臨床研究以評定急性MI后移植自體細胞在心肌再生方面的影響。大部分研究中修復(fù)細胞來源為異體骨髓細胞成分，命名為骨髓源性單核細胞(BMMNCs)。BMMNCs至少包含幾種細胞亞群：淋巴細胞、早期骨髓細胞、內(nèi)皮原始細胞及極低含量的造血干細胞和或BMSC。除了該種來源的修復(fù)細胞外，骨髓細胞的大多數(shù)純化成分如含CD34+或CD133+表面標(biāo)記的原始細胞及骨肌原細胞也被用于嚴重的心梗后左心室機能障礙。在所有上述這些研究中，自體修復(fù)細胞通過冠狀動脈內(nèi)、心肌內(nèi)或經(jīng)心外膜途徑施于。結(jié)果表明，從恢復(fù)梗死心肌灌注率方面而言，植入操作是安全、可行和有效的[22，24]，后者大多數(shù)情況歸因于BMMNCs中存在的內(nèi)皮原始祖細胞[25]和或分泌的血管源性生長因子引起的血管事件[26-28]。雖然在動物模型中積累了大量關(guān)于BMSC分化和應(yīng)用的信息，但在心肌梗死的病人中進行評定心臟功能效應(yīng)的臨床試驗仍然很少。

最近，Chen等[29]組織進行了一項隨機性研究以觀察急性MI病人冠脈內(nèi)注入BMSC后的效應(yīng)。在梗塞形成相關(guān)的冠狀動脈阻塞后，自體BMSC混懸液通過附有金屬絲的可膨脹的氣囊式導(dǎo)管直接注入目標(biāo)冠狀動脈。心動描記值顯示接受BMSC治療組與對照組有顯著差異。治療組病人運動功能減退、運動不能及運動障礙百分率下降，心梗區(qū)周圍心室壁的運動速率和左心室射血分數(shù)顯著提高。Chen等[29]報告證明總的左室射血分數(shù)顯著和持續(xù)提高，其強度甚至大于注入造血細胞后，表明MSC的注入在人心臟觸發(fā)了新的心肌細胞形成和新血管發(fā)生[16]。另外，證實冠脈內(nèi)注入BMSC不會產(chǎn)生任何以前所報道的細胞大小相關(guān)的不良反應(yīng)[20,30]。在一項前瞻性非隨機化Ⅰ期臨床試驗中，評定了冠脈搭橋術(shù)(CABG)病人心肌內(nèi)注入自體BMSC和MNCs混合物的可行性、安全性和有效性。患MI及因持續(xù)缺血宜作CABG術(shù)的病人納入本研究范疇。骨髓從研究組病人中抽取并且處理用于分離和擴增BMSC。第二次的骨髓抽取于手術(shù)當(dāng)天并用于制備MNCs。一旦所有的冠狀動脈動脈旁路吻合完成，BMSC和MNCs的混合物即沿著梗死邊緣四周注入。所有病人在此操作程序后都存活下來并且沒有出現(xiàn)手術(shù)并發(fā)癥。注入細胞后，血清標(biāo)記物的突然增高并未檢測到。手術(shù)后4個月，心臟磁共振影像學(xué)分析揭示接受細胞注入治療的患者總的左室射血分數(shù)較基礎(chǔ)值及對照組病人增加。而且，細胞治療的病人MI體積顯著減小。雖然研究的病人有限而且從細胞移植效應(yīng)中分離出手術(shù)效應(yīng)也很復(fù)雜，但是這些結(jié)果仍然能夠表明注入自體的BMSC和BMMNCs的混合物是可行、安全和極其有利的。

應(yīng)用“修復(fù)細胞”混合物取代單一細胞類型的原理在于以下的依據(jù)。首先，BMMNCs是內(nèi)皮祖細胞的一個重要來源[25]。臨床數(shù)據(jù)表明植入MNCs于MI和四肢缺血病人后，可有效促進治療性血管新生。其二，正如前面闡述，BMSC具有分化為心肌細胞樣細胞的潛能。其三，BMSC產(chǎn)生血管生成性生長因子如成纖維母細胞生長因子，血管內(nèi)皮生長因子和干細胞歸巢因子[11,31]。因此，BMSC和MNCs的共同移植可能產(chǎn)生心肌再生和血管再生二者同時增強的效果。心肌內(nèi)共同移植BMSC合并其它細胞并非沒有先例；研究結(jié)果顯示心肌內(nèi)移植BMSC合并胚胎心肌細胞或骨髓細胞引起心肌再生的顯著增加,可能緣于觸發(fā)了與新心肌發(fā)生和新血管發(fā)生和神經(jīng)芽殖及前房交感神經(jīng)分布過多的細胞和分子事件。

4問題和展望

目前認為BMSC治療心血管疾病的機制主要有[32,33]：①BMSC能夠分化為心肌細胞，修復(fù)壞死心肌；②BMSC分化為內(nèi)皮細胞，促進血管再生，重建梗死部位的血運，增加缺血區(qū)的灌注，減少梗死范圍；③BMSC的旁分泌作用，BMSC能分泌多種細胞因子，如單核細胞趨化蛋白、VEGF、成纖維細胞生長因子2、白細胞介素(IL)、血管生成素等，而上述因子已被證實有促進血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增殖，發(fā)揮促血管增殖的作用；④BMSC的其它作用。如植入的BMSC能夠下調(diào)梗死心肌I型膠原酶、Ⅲ型膠原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的表達，調(diào)節(jié)梗死局部膠原代謝，促進膠原降解，減少膠原沉積，從而減輕梗死區(qū)瘢痕的硬度及心肌纖維化程度，抑制心室擴張和梗死后心室重構(gòu)，改善心功能；植入的BMSC在心肌細胞的微環(huán)境中，與鄰近的心肌細胞產(chǎn)生電機械偶聯(lián)，與宿主心肌發(fā)生同步收縮。⑤BMSC作為基因治療的載體，轉(zhuǎn)入功能基因治療心血管疾病。

盡管基礎(chǔ)和臨床研究從不同的角度及其作用機制顯示出BMSC治療心肌梗死的潛能；然而，BMSC心血管疾病移植治療還有許多尚未解決的問題及爭議[32，34，35]：①至今尚無特異的BMSC標(biāo)記物以供分離鑒定；目前分離得到的只是一個雜合細胞群。確定BMSC的特異性分子標(biāo)記，尋找最適合細胞移植治療心血管疾病的亞群仍有待更進一步的探索。②MSCs能否分化為成熟的心肌細胞與宿主心肌細胞形成功能上的合胞體達到生理上的再生修復(fù)；③MSCs移植對心肌梗死后電重構(gòu)的影響研究不多，以至尚未明確MSCs是否具有改善心肌梗死后心律失常的作用，擬或增加心律失常的發(fā)生。④臨床適應(yīng)證。⑤移植治療的最佳時機、細胞數(shù)量和濃度、移植途徑及移植存活分化的機制。⑥遠期療效及安全性，異基因的MSCs在梗死心肌內(nèi)可以存活6個月并且表達心肌特異性標(biāo)記物，在第4周時可以觀察到實驗組比對照組左室功能明顯改善。但是這種效應(yīng)是短暫的，到6個月時此效應(yīng)消失。⑦目前常用的心肌缺血

模型多為結(jié)扎或栓塞冠狀動脈或心肌冷凍損傷，在一定程度上模擬了心肌梗死，但與冠狀動脈粥樣硬化的病理狀態(tài)還存在一定差異，更接近動脈硬化的心肌梗死模型有待進一步探討。⑧臨床研究中移植細胞的示蹤問題和分化鑒定問題，動物實驗應(yīng)用的標(biāo)記物常對供體細胞和受體都有一定毒性，因此必須尋找對人體既無損害，又便于跟蹤的細胞標(biāo)記物。⑨移植細胞能否在心肌梗死后數(shù)周或數(shù)月形成的瘢痕區(qū)域而不是僅在喪失血流后數(shù)小時的缺血區(qū)域再定居繁殖。

縱觀目前研究，BMSC移植治療心血管疾病具有良好的應(yīng)用前景，結(jié)合基因治療將可進一步提高療效。隨著各種實驗技術(shù)的發(fā)展，多學(xué)科的交叉滲透研究，BMSC面臨的問題將不斷得以解決，其治療作用和不良反應(yīng)必將不斷地被人們所掌握。

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