關于病毒感染力的滴定第1頁，課件共26頁，創作于2023年2月半數致死量LD50（50%lethaldose）半數感染量ID50(50%infectivedose)半數雞胚致死量ELD50(egg50%lethaldose)半數雞胚感染量EID50(egg50%infectivedose)半數細胞培養物感染量TCID50（tissueculture50%infectivedose)蝕斑形成單位（plaqueformingunit，PFU）測定病毒感染力的方法:第2頁，課件共26頁，創作于2023年2月將病毒作一定梯度的連續稀釋后接種于實驗動物或雞胚或培養細胞，每一稀釋度作多個重復，在一定時間內，記錄動物（雞胚）發病或死亡的數量或細胞病變的情況，利用Reed-Muench法或Karber法計算病毒的感染力。測定病毒感染力的基本過程:第3頁，課件共26頁，創作于2023年2月一、病毒TCID50的測定操作步驟在青霉素瓶中將病毒作連續10倍的稀釋，從10-1-10-10。將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養板中，每一稀釋度作8孔，每孔接種100μl。在每孔加入細胞懸液100μl，使細胞量達到3×105個/ml。第4頁，課件共26頁，創作于2023年2月設正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排。逐日觀察并記錄結果，一般需要觀察5-7天。結果的計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法第5頁，課件共26頁，創作于2023年2月10-110-210-310-410-510-610-710-8TCID50的計算方法（CalculationofTCID50）第6頁，課件共26頁，創作于2023年2月病毒液出現無CPE累計出現CPE孔稀釋度CPE孔數孔數CPE孔數無CPE孔數所占的%10-180510100（51/51）

10-280430100（43/43）

10-380350100（35/35）

10-480270100（27/27）

10-580190100（19/19）

10-67111191.7（11/12）

10-7354640（4/10）

10-8171137.1（1/14）

1、Reed-Muench法CPE：Cytopathiceffect第7頁，課件共26頁，創作于2023年2月距離比例＝（高于50%病變率的百分數-50%）/（高于50%病變率的百分數-低于50%病變率的百分數）＝（91.7-50）/（91.7-40）＝0.8第8頁，課件共26頁，創作于2023年2月lgTCID50=距離此例×稀釋度對數之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數

=0.8×(-1)+(-6)=-6.8TCID50=10-6.8／0.1ml含義：將該病毒稀釋106.8倍接種96孔細胞培養板，每孔100μl，可使50%接種孔的細胞發生病變。第9頁，課件共26頁，創作于2023年2月

2、Karber法病毒液稀釋度出現CPE的孔數出現CPE孔的比率

10-188/8=110-288/8=110-38

8/8=110-488/8=110-58

8/8=110-67

7/8=0.87510-73

3/8=0.37510-811/8=0.125第10頁，課件共26頁，創作于2023年2月lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高濃度的稀釋度的對數D：稀釋度對數之間的差S：陽性孔比率總和lgTCID50=-1-1×(6.375-0.5)=-6.875TCID50=10-6.875/0.1ml第11頁，課件共26頁，創作于2023年2月二、病毒蝕（噬）斑技術病毒蝕斑（plaque)

又稱空斑，指病毒在已長成的單層細胞上形成的局限性病灶。第12頁，課件共26頁，創作于2023年2月原理：適當稀釋的病毒懸液接種已經長成單層的敏感細胞后，在覆蓋的固體或半固體介質（瓊脂糖、甲基纖維素）的作用下，病毒在最初感染的細胞內增殖后，只能進而感染并破壞臨近的細胞，經過幾個增殖周期后，形成一個局限性的肉眼可見的病變細胞區，即局限性的病灶。plaques第13頁，課件共26頁，創作于2023年2月Procedures第14頁，課件共26頁，創作于2023年2月操作步驟將敏感細胞在平皿或6孔板內培養成單層吸棄培養液，加入含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗1-2次。用維持液將病毒液作連續10倍的稀釋，選擇適當稀釋度的病毒懸液接種培養孔內的單層細胞，接種量約為原培養液的1/10-1/5，以覆蓋住細胞單層為宜，每個稀釋度接種2-3孔。（一）用瓊脂糖覆蓋，中性紅染色第15頁，課件共26頁，創作于2023年2月將培養板置37℃5%CO2培養箱吸附1h，吸棄病毒液，用含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗3次。取1.6%-2%的低熔點瓊脂糖，融化后降溫至38-42℃，與等量預熱至38-42℃含6%-10%犢牛血清的無酚紅DMEM混合，注入細胞培養板中。第16頁，課件共26頁，創作于2023年2月室溫放置直至瓊脂糖凝固，或于4℃冰箱放置幾分鐘至瓊脂糖凝固，然后于37℃5%CO2培養箱繼續培養。每天于顯微鏡下觀察細胞病變情況。出現空斑后（2-3天），用含鈣、鎂的PBS將0.1%的中性紅貯存液10倍稀釋后滴加到細胞培養板上。于37℃5%CO2培養箱中作用1h，吸棄染液，繼續于溫箱中培養2-3h。第17頁，課件共26頁，創作于2023年2月TK-突變株與野毒形成的空斑的比較第18頁，課件共26頁，創作于2023年2月（二）用甲基纖維素覆蓋，結晶紫染色將敏感細胞在平皿或6孔板內培養成單層。吸棄培養液，加入含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗1-2次。用維持液將病毒液作連續10倍的稀釋，選擇適當稀釋度的病毒懸液接種培養孔內的單層細胞，接種量約為原培養液的1/10-1/5，以覆蓋住細胞單層為宜，每個稀釋度接種2-3孔。將培養板置37℃5%CO2培養箱吸附1h，吸棄病毒液，用含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗3次。第19頁，課件共26頁，創作于2023年2月覆蓋配好的4%羧甲基纖維素鈉（含3%新生牛血清）。48-72h后，待細胞出現病變或蝕斑時，各孔補滿10%中性甲醛，固定4h以上。棄掉孔中液體，流水側板沖洗數次。各孔補加配好的結晶紫溶液（0.35%、w/v），作用15min。棄掉染液，繼續沖洗數次，在37℃溫箱中敞口烘干，顯微鏡下計空斑數。第20頁，課件共26頁，創作于2023年2月第21頁，課件共26頁，創作于2023年2月蝕斑技術的應用：用于病毒純化：挑選病毒的克隆株測定病毒懸液中感染病毒的含量第22頁，課件共26頁，創作于2023年2月如果是作病毒純化

挑取空斑于200μL維持液中，反復凍融3次，接種于PK-15細胞已長成單層的24孔細胞培養板，再于37℃5%CO2培養箱培養至完全發生病變。第23頁，課件共26頁，創作于2023年2月一般的毒種純化：收集病變的細胞懸液，通過PCR或其它方法進行鑒定，并測定TCID50，然后選TCID50較高者再作幾輪空斑純化，獲得高滴度的病毒，擴大培養后作種用。篩選重組病毒：收集病變的