------------------------------------------------------------------------常用的微生物分離純化方法(一)常用的微生物分離純化方法

菌種分離純化的方法有：稀釋混合倒平板法、稀釋涂布平板法、平板劃線分離法、稀釋搖管法、液體培養基分離法、單細胞分離法、選擇培養分離法等。其中前三種方法最為常用,不需要特殊的儀器設備,分離純化效果好,現分別簡述如下

1.稀釋混合倒平板法

平板是指經熔化的固體培養基倒入無菌培養皿中,冷卻凝固而成的盛有固體培養基的平皿。該法是先將待分離的含菌樣品,用無菌生理鹽水作一系列的稀釋(常用十倍稀釋法,稀釋倍數要適當),然后分別取不同稀釋液少許(0.5-1.0ml)于無菌培養皿中,傾入已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養基,迅速旋搖,充分混勻。待瓊脂凝固后,即成為可能含菌的瓊脂平板。

于恒溫箱中倒置培養一定時間后,在瓊脂平板表面或培養基中即可出現分散的單個菌落。每個菌落可能是由一個細胞繁殖形成的。挑取單一個菌落,一般再重復該法1-2次,結合顯微鏡檢測個體形態特征,便可得到真正的純培養物。若樣品稀釋時能充分混勻,取樣量和稀釋倍數準確,則該法還可用于活菌數測定。

圖4混合倒平板操作法示意圖圖5涂布平板操作法示意圖

2.稀釋涂布平板法

采用上述稀釋混合倒平板法有兩個缺點，一是會使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間,缺乏溶氧而生長受影響,形成的菌落微小難于挑取；一是在傾入熔化瓊脂培養基時，若溫度控制過高,易燙死某些熱敏感菌，過低則會引起瓊脂太快凝固,不能充分混勻。

在微生物學研究中,更常用的純種分離方法是稀釋涂布平板法。該法是將已熔化并冷卻至約50℃(減少冷凝水)的瓊脂培養基,先倒入無菌培養皿中,制成無菌平板。待充分冷卻凝固后,將一定量(約0.1ml)的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面,再用三角形無菌玻璃涂棒涂布,使菌液均勻分散在整個平板表面,倒置溫箱培養后挑取單個菌落。

另一種簡單快速有效的涂布平板法,可省去含菌樣品懸液的稀釋,直接吸取經振蕩分散的樣品懸浮液l滴加入1號瓊脂平板上,用一支三角形無菌玻璃涂棒均勻涂布,用此涂棒再連續涂布2號、3號、4號平板(連續涂布起逐漸稀釋作用，涂布平板數視樣品濃度而定),翻轉此涂棒再涂布5號、6號平板,經適溫倒置培養后挑取單個菌落。該法可稱之為玻璃涂棒連續涂布分離法。

3.平板劃線分離法

先倒制無菌瓊脂培養基平板,待充分冷卻凝固后,用接種環以無菌沾取少量待分離的含菌樣品,在無菌瓊脂平板表面進行有規則的劃線。劃線的方式有連續劃線、平行劃線、扇形劃線或其它形式的劃線。通過這樣在平板上進行劃線稀釋,微生物細胞數量將隨著劃線次數的增加而減少,并逐步分散開來。經培養后,可在平板表面形成分散的單個菌落。但單個菌落并不一定是由單個細胞形成的，需再重復劃線1-2次,并結合顯微鏡檢測個體形態特征,才可獲得真正的純培養物。該法的特點是簡便快速。

圖6平板劃線分離操作法示意圖

個體細胞的生長難以測定,而且生長與繁殖是交替進行的,因此，微生物的生長繁殖一般不是依據個體細胞的大小,而是以群體細胞數目的增加作為指標的。測定微生物細胞數量的方法很多,主要有顯微鏡直接計數法、平板菌落計數法、光電比濁法、最大可能數(MPN)法、膜過濾法等。

測定酵母細胞數或霉菌孢子數常采用在顯微鏡下直接進行計數的方法,該計數方法被廣泛應用于酒精、啤酒和白酒等的工業化生產中。

平板菌落計數法被廣泛應用于食品、飲品、水質和活菌制劑等的含菌指數或污染程度的檢測。該計數方法又稱平板活菌計數法,其最大優點是可以獲得活菌數的信息。但是,該計數法操作過程較繁,需要培養一定時間才有結果,且測定結果易受多種因素的影響。

光電比濁計數法是采用光電比色計或分光光度計,測定菌懸液的光密度或透光度,其優點是簡便迅速,可以連續測定,適合于自動控制。但該法除了受菌體濃度影響外,還受細胞形態、大小、培養液成分及所采用光波長等因索的影響。

(一)顯微鏡直接計數法

該法是將酵母菌或霉菌孢子懸液,放在血球計數器載玻片與蓋玻片之間的計數室中，在顯微鏡下直接進行計數，是一種常用的微生物計數方法。

Thoma血球計數板是一塊特制的厚載玻片,玻片的中間部分刻有四條溝槽,形成三個平臺。中間的平臺較寬且比兩邊的平臺略低,其中央刻有一小方格網的計數區,計數區的面積為l平方毫米。另一種計數器中間平臺的中間又被一短的橫溝槽分為兩半,成為兩個小平臺,每個小平臺上面各刻有一個計數區,共有兩個計數區。當蓋上特定蓋玻片時,蓋玻片與計數室的空間厚度正好是0.l毫米,這樣計數室的體積為0.l立方毫米,即0.000l毫升。計數室有兩種刻度形式,一種是全區分16大格,每大格再分25小格,一共400小格。另一種是全區分25大格,每大格再分16小格,也是400小格。

計數時,可將酵母菌液(或孢子懸液)充滿計數室,在顯微鏡下按規定數4個或5個大格的總細胞數,再求得每小格內平均的細胞數,即可計算出每ml培養液中的細胞總數。

每ml菌液酵母菌細胞數=每小格平均酵母細胞數×400×10000×稀釋倍數。

(二)平板菌落計數法

該法的基本原理是：將待測含菌樣品經適當稀釋,使其中的微生物充分分散成單個細胞,然后取一定量的稀釋樣品液,接種到平板上。經過一定時間培養后,由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的單菌落,即一個單菌落應代表原樣品中的一個活菌。最后統計菌落數,根據其稀釋倍數和取樣量,換算出單位樣品中所含的活菌數。

實際上，由于待測樣品不易完全分散成單個細胞,故所形成的菌落并非都是單菌落,有一部分是由2個以上的細胞長成的,因此平板菌落計數的結果會比實際偏低?，F在已采用菌落形成單位(cfu)來表示樣品的活菌含量。

(三)光電比濁計數法

光電比濁計數法的原理是：光線透過菌懸液時,其透光率與細胞濃度成反比,而光密度與細胞濃度成正比。透光率或光密度可以由光電池精確測出(光波通常選