第3章第2節人教版選擇性必修3抗蟲棉Bt抗蟲蛋白蘇云金桿菌蘇-基因1蘇-基因2蘇-基因3蘇-基因4Bt基因蘇云金桿菌DNA片段中的部分基因棉-基因1棉-基因2棉-基因3棉-基因4棉花細胞DNA片段中的部分基因“分子手術刀”“分子縫合針”實際操作和這一樣都在體外進行嗎？首先要在體外對含有所需要基因的DNA分子進行“切割”、改造和“拼接”；然后，將重組DNA分子導入棉花體細胞內，并使其在細胞中表達。體外導入載體棉花細胞的DNA不進行切割DNA連接酶重組DNA限制酶當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環境中才能表現出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體。因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產生上述影響。相關信息1.目的基因的篩選和獲取2.基因表達載體的構建3.將目的基因導入受體細胞4.目的基因的檢測與鑒定第二步：基因表達載體的構建二/第一步：目的基因的篩選與獲取一/目錄CONTENTS第三步：將目的基因導入受體細胞三/第四步：目的基因的檢測與鑒定四/DNA片段的擴增及電泳鑒定五/01第一步：目的基因的篩選與獲取一第一步：目的基因的篩選與獲取目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因就是目的基因。主要是指編碼蛋白質的基因注意：不是所有的基因都編碼蛋白質或肽鏈。（了解）基因的種類一般分為結構基因、轉錄基因和調控基因。結構基因的功能：具有轉錄和翻譯功能，能控制生物性狀（編碼蛋白質或肽鏈）。轉錄基因的功能：只有轉錄功能，沒有翻譯功能。能轉錄形成tRNA和rRNA調控基因的功能：不能進行轉錄和翻譯，只能調控其他基因的表達。一第一步：目的基因的篩選與獲取目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因就是目的基因。主要是指編碼蛋白質的基因注意：不是所有的基因都編碼蛋白質或肽鏈。（了解）基因的種類一般分為結構基因、轉錄基因和調控基因。結構基因的功能：具有轉錄和翻譯功能，能控制生物性狀（編碼蛋白質或肽鏈）。轉錄基因的功能：只有轉錄功能，沒有翻譯功能。能轉錄形成tRNA和rRNA調控基因的功能：不能進行轉錄和翻譯，只能調控其他基因的表達。如：Bt抗蟲蛋白基因，簡稱Bt基因Bt抗蟲蛋白使棉花抗蟲轉基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環斑病毒轉基因抗除草劑植物一第一步：目的基因的篩選與獲取目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因就是目的基因。主要是指編碼蛋白質的基因如：Bt抗蟲蛋白基因，簡稱Bt基因Bt抗蟲蛋白使棉花抗蟲轉基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環斑病毒轉基因抗除草劑植物……抗逆性毒物降解轉基因芥屬能多吸收土壤中5.3倍的有毒金屬硒，而自身卻不會死亡一第一步：目的基因的篩選與獲取目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因就是目的基因。主要是指編碼蛋白質的基因使棉花抗蟲轉基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環斑病毒轉基因抗除草劑植物……抗逆性毒物降解轉基因芥屬能多吸收土壤中5.3倍的有毒金屬硒，而自身卻不會死亡生產藥物重組人胰島素注射液工業用酶那么，如何篩選目的基因呢？如：現在需要選擇一種抗蟲基因，該如何篩選？Bt毒蛋白基因是從蘇云金芽孢桿菌中分離出來的抗蟲基因。當害蟲食用含有轉基因的植物時，Bt基因編碼的蛋白質會進入害蟲的腸道，在消化酶的作用下，蛋白質能夠降解成相對分子質量比解，最后造成害蟲死亡。由于Bt毒蛋白對哺乳動物無毒害作用，因而廣泛用于抗蟲轉基因植物。蛋白酶抑制劑基因廣泛存在于植物中它生的抑制劑可與害蟲消化道中的蛋白酶結合形復合物，從而阻斷或降低蛋白酶的活性，使昆蟲不能正常攝取、消化食物中的蛋白質。這種復合物還能刺激昆蟲分泌過量的消化酶，引起害蟲的厭食反應。淀粉酶抑制劑基因產生的粉酶抑制劑可以抑制昆蟲消化道中的淀粉酶活性,使害蟲不能消化所攝取的淀粉，從而阻斷害蟲的能量來源。植物凝集素基因控制植物合成一種糖蛋白糖蛋白可與昆蟲腸道黏膜上的某種物質結而影響害蟲對營養物質的吸收和利用。資料卡：可用于轉基因植物的抗蟲基因如何選擇？一第一步：目的基因的篩選與獲取從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。P271.3發酵工程及其應用在培育轉基因抗蟲棉之前，用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害已有多年歷史。——篩選一第一步：目的基因的篩選與獲取從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。P271.3發酵工程及其應用在培育轉基因抗蟲棉之前，用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害已有多年歷史。研究表明，蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關。科學家不僅掌握了Bt基因的序列信息，也對Bt基因的表達產物—Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解。因此，Bt基因是培育轉基因抗蟲棉較為合適的目的基因。還有沒有其他篩選方法？——篩選——篩選一第一步：目的基因的篩選與獲取DNA測序序列數據庫（如GenBank）序列比對工具（如BLAST）BLAST全稱BasicLocalAlignmentSearchTool，即“基于局部比對算法的搜索工具”，是生物信息學常用的工具軟件，可將輸入的核酸或蛋白質序列與數據庫中的已知序列進行比對，獲得序列相似度等信息，從而判斷序列的來源或進化關系。序列數據庫是分子生物信息數據庫中最基本的數據庫，包括核酸和蛋白質兩類，以核苷酸堿基順序或氨基酸殘基順序為基本內容，并附有注釋信息。明確了目的基因后，該怎么獲得它呢？一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取獲取目的基因的常用方法有：人工合成從基因文庫中獲取利用PCR獲取和擴增目的基因一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取2.從基因文庫中獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。（了解）基因文庫基因組文庫cDNA文庫一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取基因組文庫2.從基因文庫中獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。（了解）基因文庫cDNA文庫將某種生物體內的DNA全部提取出來，選用適當的限制酶，將DNA切成一定范圍大小的DNA片段，然后，將這些DNA片段分別與載體連接起來，導入受體菌的群體中儲存，每個受體菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是說，這個群體包含了這種生物的所有基因，叫做這種生物的基因組文庫。一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取某種生物體內的全部DNA適當的不同限制酶切割與質粒連接一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取某種生物體內的全部DNA適當的不同限制酶切割與質粒連接受體菌導入受體菌一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取某種生物體內的全部DNA適當的不同限制酶切割與質粒連接受體菌導入受體菌每個受體菌都含有了一段不同的DNA片段。這個群體包含了這種生物的所有基因，叫做這種生物的基因組文庫。該受體菌群為基因組文庫一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取cDNA文庫如果用某種生物發育的某個時期的mRNA反轉錄產生的多種互補DNA(也叫cDNA)片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，那么，這個受體菌群體就叫做這種生物的cDNA文庫。某種生物體內的全部DNA某個時期基因選擇性表達轉錄轉錄轉錄轉錄mRNA翻譯翻譯翻譯翻譯蛋白質CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---某原核細胞基因非編碼區非編碼區編碼區不編碼mRNA不編碼mRNA(編碼mRNA)啟動子終止子啟動子：啟動子是RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列終止子：給予RNA聚合酶轉錄終止信號的DNA序列RNA聚合酶--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區非編碼區編碼區(編碼mRNA)啟動子終止子啟動子：啟動子是RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列終止子：給予RNA聚合酶轉錄終止信號的DNA序列CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉錄mRNA某原核細胞基因--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區非編碼區編碼區(編碼mRNA)啟動子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉錄mRNA翻譯蛋白質某原核細胞基因如果該基因為真核細胞基因有什么不同？CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---某真核細胞基因非編碼區非編碼區編碼區不編碼mRNA不編碼mRNA(編碼mRNA)啟動子終止子RNA聚合酶外顯子內含子外顯子內含子外顯子外顯子：編碼蛋白質的序列稱為外顯子內含子：外顯子之間不能編碼蛋白質的序列稱為內含子--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區非編碼區編碼區(編碼mRNA)啟動子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉錄初始mRNA某真核細胞基因外顯子內含子外顯子內含子外顯子外顯子：編碼蛋白質的序列稱為外顯子內含子：外顯子之間不能編碼蛋白質的序列稱為內含子外顯子和內含子均會被轉錄成RNA，再經過切去內含子對應部位、連接外顯子對應部位等RNA加工過程，形成可以直接用于翻譯的mRNA--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區非編碼區編碼區(編碼mRNA)啟動子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉錄某真核細胞基因外顯子內含子外顯子內含子外顯子RNA加工CA……UAGGAUCCAGAUG翻譯蛋白質外顯子和內含子均會被轉錄成RNA，再經過切去內含子對應部位、連接外顯子對應部位等RNA加工過程，形成可以直接用于翻譯的mRNA初始mRNA成熟mRNAcDNA文庫如果用某種生物發育的某個時期的mRNA反轉錄產生的多種互補DNA(也叫cDNA)片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，那么，這個受體菌群體就叫做這種生物的cDNA文庫。--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區非編碼區編碼區(編碼mRNA)啟動子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉錄mRNA翻譯蛋白質某原核細胞基因--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區非編碼區編碼區(編碼mRNA)啟動子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉錄mRNA翻譯蛋白質某原核細胞基因反轉錄GT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTACCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……GT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……cDNA復制雙鏈DNA受體菌無啟動子、終止子等非編碼區--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區非編碼區編碼區(編碼mRNA)啟動子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉錄某真核細胞基因外顯子內含子外顯子內含子外顯子RNA加工CA……UAGGAUCCAGAUG翻譯蛋白質初始mRNA成熟mRNA--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區非編碼區編碼區(編碼mRNA)啟動子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉錄某真核細胞基因外顯子內含子外顯子內含子外顯子RNA加工CA……UAGGAUCCAGAUG翻譯蛋白質初始mRNA成熟mRNA反轉錄GT……ATCCTAGGTCTACGT……ATCCTAGGTCTACCA……TAGGATCCAGATG復制受體菌無啟動子、終止子等非編碼區及無內含子文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）基因中內含子（位于編碼蛋白質序列內的非編碼DNA片段）基因多少小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取2.從基因文庫中獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。（了解）基因組文庫cDNA文庫某種生物體內的全部DNA適當的不同限制酶切割與質粒連接受體菌導入受體菌怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢？某種生物體內的全部DNA轉錄轉錄轉錄轉錄mRNA反轉錄反轉錄反轉錄反轉錄cDNA一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取2.從基因文庫中獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。（了解）基因組文庫cDNA文庫某種生物體內的全部DNA適當的不同限制酶切割與質粒連接受體菌導入受體菌怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢？一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取2.從基因文庫中獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。（了解）基因組文庫cDNA文庫某種生物體內的全部DNA適當的不同限制酶切割與質粒連接受體菌導入受體菌怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢？這還是一件比較復雜的事情，簡單地說就是根據目的基因的有關信息，例如根據基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉錄產物mRNA以及基因翻譯產物蛋白質等特性來獲取目的基因。3.利用PCR獲取和擴增目的基因一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取（常用方法）從DNA文庫中獲取并擴增目的基因通常采用PCRPCR（polymerasechainreaction）聚合酶鏈反應聚合酶鏈式反應是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。DNA半保留復制。體外（PCR擴增儀/PCR儀）。對目的基因的核苷酸序列進行大量復制。可以在短時間內大量擴增目的基因。原理：操作環境：目的：優點：模擬體內DNA復制過程一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取某種生物體內的全部DNA適當的不同限制酶切割與質粒連接受體菌導入受體菌參與的組分在DNA復制中的作用打開DNA雙鏈提供DNA復制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸體內DNA復制所需的基本條件解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物體外復制怎么改進？一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取某種生物體內的全部DNA適當的不同限制酶切割與質粒連接受體菌導入受體菌參與的組分在DNA復制中的作用打開DNA雙鏈提供DNA復制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸體內DNA復制所需的基本條件解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物體外復制怎么改進？體外用高溫代替體外需用耐高溫的DNA聚合酶引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物長度通常為20?30個核苷酸。體外復制的引物一般為DNA單鏈。復制的原料實為dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同時水解產生能量為合成DNA子鏈提供能量，因此體系中不需要添加ATP。微量離心管緩沖液PCR反應需要在一定的緩沖溶液中才能進行。真核