基因操作的基本步驟演示文稿目前一頁\總數二十九頁\編于十三點基因操作的基本步驟目前二頁\總數二十九頁\編于十三點從細胞中分離出DNA從大腸桿菌中提取質粒限制酶提取目的基因限制酶目的基因與運載體結合DNA連接酶目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與表達三、基因工程操作的基本步驟目前三頁\總數二十九頁\編于十三點目前四頁\總數二十九頁\編于十三點基因操作“四部曲”——即四個基本步驟：1）提取目的基因2）目的基因于運載體結合3）將目的基因導入受體細胞4）目的基因的檢測和表達目前五頁\總數二十九頁\編于十三點步驟一：提取目的基因

目的基因是人們所需要轉移或改造的基因,獲取目的基因是實施基因工程的第一步。如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗病（抗病毒、抗細菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。目前六頁\總數二十九頁\編于十三點目的基因的提取方法直接分離基因人工合成基因反轉錄法根據已知的氨基酸序列合成DNA：鳥槍法目前七頁\總數二十九頁\編于十三點1.鳥槍法（散彈射擊法）

用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別轉入不同的受體細胞，讓供體細胞提供的外源DNA的所有片段分別在各個受體細胞中大量復制（即擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再利用一定發方法將目的基因的DNA片段分離出來。用限制酶切斷成許多片段目前八頁\總數二十九頁\編于十三點（2）基因文庫的建立方法提取某種生物的全部DNA用適當的限制酶酶切一定大小的DNA片段將DNA片段與運載體連接導入受體菌中儲存基因組文庫方法一：直接分離法(鳥槍法)目前九頁\總數二十九頁\編于十三點1）反轉錄法：以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA)雙鏈DNA(即目的基因)反轉錄合成2.人工合成基因法目前十頁\總數二十九頁\編于十三點2）根據已知的氨基酸序列合成DNA法：根據已知蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結構基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成目前十一頁\總數二十九頁\編于十三點上述三種目的基因提取的方法有何優缺點？優點缺點鳥槍法反轉錄法根據已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時并非一個基因專一性強操作過程麻煩，mRNA很不穩定，要求的技術條件較高專一性最強僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因目前十二頁\總數二十九頁\編于十三點哪些新技術能大大簡化基因工程的操作技術？1）DNA序列自動測序儀：2）PCR技術：對提取出來的基因進行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增。目前十三頁\總數二十九頁\編于十三點目前十四頁\總數二十九頁\編于十三點步驟二：目的基因與運載體結合1）用一定的限制酶切割質粒，使其出現一個切口，露出黏性末端。2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端。3）將切下的目的基因片段插入質粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質粒）目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。目前十五頁\總數二十九頁\編于十三點目前十六頁\總數二十九頁\編于十三點常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因導入受體細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。步驟三：將目的基因導入受體細胞目前十七頁\總數二十九頁\編于十三點①直接導入法有電擊、顯微注射、直接吸收、基因槍等方法。（1）電擊法：借助電擊儀高壓脈沖把目的基因打入宿主細胞。（2）顯微注射法：利用微量注射器在顯微鏡下直接把目的基因注入宿主細胞。（3）直接吸收法：把目的基因和宿主細胞混在一起，讓其吸收。（4）基因槍法：在金屬微粒上涂一層目的基因，然后發射到宿主細胞中。②間接導入法常用的載體是質粒、λ噬菌體、科斯質粒。（1）質粒是細菌染色體DNA以外的環狀雙鏈DNA分子，它能自我復制，也可整合到細胞染色體DNA中與其一起表達。質粒通常還含有標記基因，這可以從細胞的表型特征來識別。（2）λ噬菌體是一種細菌病毒，其環狀雙鏈DNA可以作為目的基因的載體。（3）科斯質粒是一種雜種質粒，含有質粒和λ噬菌體的部分順序，很適合用作真核生物基因的載體。目前十八頁\總數二十九頁\編于十三點1.將目的基因導入植物細胞目前十九頁\總數二十九頁\編于十三點2.將目的基因導入動物細胞目前二十頁\總數二十九頁\編于十三點1）將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性。2）使含有目的基因的重組質粒進入受體細胞。3）目的基因在受體細胞內，隨其繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非常快，在很短的時間內就能獲得大量的目的基因。例如：將目的基因導入微生物細胞目前二十一頁\總數二十九頁\編于十三點步驟四：目的基因的檢測和表達四環素抗性基因氨芐青霉素抗性基因檢測是否導入：看標記基因控制的性狀是否表現目前二十二頁\總數二十九頁\編于十三點不能，受體細胞必須表現出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。檢測是否表達：看目的基因控制的性狀是否表現目前二十三頁\總數二十九頁\編于十三點多細胞生物的檢測，將每個受體細胞單獨培養并誘導發育成完整個體，檢測這些個體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達（是否表現出相應的性狀）。淘汰無變化的個體，保留有相應變化的個體進一步培養、研究。例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。目前二十四頁\總數二十九頁\編于十三點目前二十五頁\總數二十九頁\編于十三點1）以下說法正確的是（）A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B、質粒是基因工程中唯一的運載體C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現出來C練習目前二十六頁\總數二十九頁\編于十三點2）不屬于質粒被選為基因運載體的理由是A、能復制（）B、有多個限制酶切點C、具有標記基因D、它是環狀DNAD練習目前二十七頁\總數二十九頁\編于十三點3）有關基因工程的敘述中，錯誤的是（）A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B、限制性內切酶用于目的基因的獲得C、目的基因須由運載體導入受體細胞D、人工合成目的基因不用限制性內切酶A練習目前二十八