蛋白酶活力測定第1頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四一、概述1．什么是酶？2．影響酶催化反應的因素3．什么是酶的活力?4．測定意義5.測定方法第2頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四生物催化劑特殊催化功能的蛋白質酶的特性:（1）作用有專一性、選擇性（2）催化速度快（3）反應條件溫和（4）化學本質是蛋白質一種酶只作用一種底物：淀粉酶：只能催化淀粉水解→糊精、低聚糖；蛋白酶：只能催化蛋白質水解→氨基酸、肽；

在激烈振蕩、加熱、紫外線、X-射線的照射，重金屬鹽作用下，它的二、三結構會發生改變。而變性，失去催化能力這種現象叫做酶的失活

第3頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四底物濃度pH溫度時間第4頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四

V

Vmax

底物濃度C

C0

飽和濃度底物濃度第5頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四

OD

pHpH最適溶液pH的影響第6頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四酶的分類酸性蛋白酶3350pH最適=2～4；7401pH最適=3.0中性蛋白酶1398pH最適=7～7.5；166pH最適=7～8堿性蛋白酶2709pH最適=9～11；209pH最適=9.5～11第7頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四

OD

T（℃）

T最適溫度的影響第8頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四3350：T最適：45℃-47℃40℃以下穩定1398：T最適：30℃-37℃（pH：6.0-6.5）

T最適：40℃-50℃（pH：7.0-7.5）2709：T最適：45℃-55℃40℃以下穩定。

第9頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四

Q（反應物的消耗量或生成物的生成量)

t0

t

作用時間的影響oAdQdtKdQdtv第10頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四結論酶催化反應在反應初速度時間內最適溫度最適pH飽合底物濃度在最大活力處比較第11頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四在一定溫度、pH條件下，1g酶粉或1ml酶液，每分鐘催化水解酪蛋白（或血紅蛋白）所產生的酪氨酸的微克數，稱為酶的活力。表示為：單位/g或單位/ml。通常人們愛講多少個單位。如一般出廠酶活力為5萬單位，即：50000μg/g=0.05g酪氨酸/1g酶粉。蛋白酶的活力定義：第12頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四測定意義生皮蛋白質

膠原蛋白（80%-85%）非膠原蛋白

彈性蛋白網硬蛋白間質蛋白酶的活力會下降酶的催化能力強第13頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四測定方法乙醇滴定法、甲醛滴定法等Folin-酚法，紫外分光光度法，殘氮量測定法等等。Gross法、明膠粘度下降法、凝乳作用法酸性蛋白酶活性，還可以根據胰蛋白酶原激活作用的大小來表示。

第14頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四福林試劑，在堿性情況下極不穩定。可被酚類化合物還原，而呈藍色反應。由于蛋白質或水解產物中含有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸等)也呈這個反應，因此可以利用這個原理來測定蛋白酶活性的強弱。二、測定原理第15頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四1．酶催化反應酪蛋白酶催化條件酪氨酸白色至黃色粉沫，無臭無味，溶于稀堿、濃酸，在弱酸中沉淀，幾乎不溶于水，有吸濕性，干燥時穩定，潮濕時迅速變質。條件：底物濃度溫度pH時間選擇：C0

T最適pH最適t0措施：C≥C0

恒溫水浴緩沖溶液t=

t0例子：5370.5%酪蛋白40℃3.010min例子：13980.5%酪蛋白40℃7.510min例子：27090.5%酪蛋白40℃1010min第16頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四

2.顯色反應

福林試劑+酪氨酸OH-

HO—

—CH2—CH—COOH

還原性NH2鉬藍+鎢藍藍色物質第17頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四顯色劑

Na2WO4Na2MoO4H2OH3PO4福林試劑→

HCLLi2SO4Br2顯色劑亮金黃色第18頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四3．朗伯-比爾定律及其應用E

——

吸光度A

——

消光值OD

——

光密度

E=K·Ｃ·L=lg（I0/I）=K′·C透光率T=II0入射光強度I0透過光強度I有色真溶液CL第19頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四朗伯-比爾定律的應用[X]→[RX]→OD被測組分的濃度與光密度OD成直線關系[X]OD

OD=K·C[RX]OD=K′·C[X]

第20頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四①選擇λmax注意:λmax=680nm②OD值的范圍OD=0.2～0.6OD=0.43第21頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四4．制作標準曲線酪氨酸濃度COD

C1OD1C2OD2C3OD3

···

···CnODn第22頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四福林—酚法測定蛋白酶活力

方法要點

配制系列濃度的酪氨酸標準溶液，在一定條件下（T、pH、t）與福林試劑顯色后，測定光密度OD值。繪制標準曲線。精稱酶制劑，配成適當濃度的溶液。以酪素為底物，在一定溫度、pH下與上述酶液作用一定時間，用三氯醋酸終止反應,并使未水解的酪素沉淀，過濾，移取濾液，加入碳酸鈉調節pH為堿性，再加入福林試劑，顯色后測定光密度，與標準曲線比較，計算出被測酶制劑的活力。第23頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四

三、試劑10﹪CL3CCOOH水溶液0.55mol/L碳酸鈉溶液緩沖溶液福林試劑顯色劑一種雜多酸磷鉬酸H3[P（Mo3O10）4]磷鎢酸H3[P（W3O10）4]第24頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四福林試劑的配制Na2WO4·2H2O100g

Na2MoO4·2H2o25gLi2SO450gH2O100ml10hr+85﹪H3PO450mlH2O50ml濃HCL100ml

混勻+溴水15`冷卻→黃色→過濾

Δ回流Δ

金黃色溶液第25頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四(1)檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液

pH=3.0A液：0.1mol/L檸檬酸21.01gC6H8O7·H2O→1000mlCH2—COOHHO—C—COOHCH2—COOHB液：0.1mol/L檸檬酸納29.4gNa3C6H5O7·2H2O→1000ml用時：A∶B=18.6∶1.4混合第26頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四檸檬酸—檸檬酸鈉溶液的pH計算弱酸—弱酸鹽緩沖體系

pH=pka1+lg（C酸/C鹽）=3.13+lg（C酸/C鹽）檸檬酸:

pKa1

=3.13

pKa2=4.76

pKa3=6.40第27頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四（2）0.02mol/L的磷酸鹽緩沖溶液A液：0.2mol/LNaH2PO4溶液31.2gNaH2PO4·2H2O→1000mlB液：0.2mol/LNa2HPO4溶液71.7gNa2HPO4·12H2O→

1000ml第28頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四①pH=7.2的磷酸鹽緩沖溶液A液28ml

B液72mlH2O1000ml②pH=7.5的磷酸鹽緩沖溶液A液16mlB液84mlH2O1000ml第29頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四磷酸鹽緩沖溶液pH計算

pH=pKa

+lg（C酸/C鹽）[H2PO4-]=7.21+lg————[HPO4=]

Ka2

=6.17×10-8第30頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四（3）硼砂—氫氧化納緩沖溶液

pH=10A液：0.055mol/LNa2B4O7

·8H2O19gNa2B4O7

·8H2O1000mlB液：0.2mol/LNaOH8gNaOH 1000mlA液50mlB液43ml

H2O

200ml第31頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四硼砂—氫氧化納緩沖溶液的pH計算弱酸—弱酸鹽緩沖體系Na2B4O7+7H2O═NaOH+4H3BO3H3BO3+H2O═B(OH)4-+H+

一元弱酸Ka=5.6×10-10pH=pka1-lg（C酸/C鹽）=9.24-lg（C酸/C鹽）第32頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四

四、操作手續（一）制作標準曲線1．配制100μg/ml酪氨酸標準溶液2．配制系列濃度的酪氨酸標準溶液3.與福林試劑反應顯色，測OD值4.繪制標準曲線（二）測定蛋白酶活力——實測1．緩沖溶液的配制2．底物配制3．待測酶液配制4．測定第33頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四（一）制作標準曲線1．配制100μg/mL酪氨酸標準溶液

0.1000g酪氨酸0.1mol/LHCL

100ml容量瓶

1mg/ml=1000μg/ml再移取10ml

0.1mol/LHCL

100ml容量瓶

0.1mg/ml=100μg/ml第34頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四思考題為什么酪氨酸要干燥至恒重？為什么酪氨酸要稱準至0.1000g？為什么酪氨酸用鹽酸溶解？為什么要先配成1000ug/ml，再配成100ug/ml？第35頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四2．配制系列濃度的酪氨酸標準溶液第36頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四3．系列濃度的酪氨酸顯色并測OD值酪氨酸標準溶液1ml搖勻10分鐘藍色冷卻1cm比色皿680nm波長5ml0.55mol/LNa2CO340℃水浴0號調零，測OD值福林試劑1ml第37頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四說明（1）各試劑均用刻度移液管移取（2）顯色后需冷卻到室溫（3）每一點測兩份，ΔOD≤0.01

共3×6＝18支干試管第38頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四4．數據處理（1）畫圖求直線斜率的倒數K（2）計算K（3）直接查取（4）計算機處理，回歸曲線：C=K.OD第39頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四（1）畫圖求直線斜率的倒數K

ΔC

K=

ΔOD（μg/ml

OD）ODCC（μg/ml）ΔCΔOD第40頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四（2）計算K

Kn=

K1+K2+K3+K4+K5

K=

CnODn5第41頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四

（3）直接查取（4）計算機處理，回歸曲線：C=KOD第42頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四

（二）測定蛋白酶活力——實測

1．緩沖溶液的配制2．底物配制3．待測酶液配制4．測定第43頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四1．緩沖溶液的配制酸性蛋白酶。如：537pH最適=3.0檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液pH=3.0

中性蛋白酶。如：1398pH最適=7～7.5；0.02mol/L的磷酸緩沖溶液pH=7.5堿性蛋白酶。如：2709pH最適=9～11；硼砂—氫氧化納緩沖溶液pH=10第44頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四2．底物配制中性、堿性蛋白酶0.5或2﹪酪素≥飽合濃度

第45頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四0.5﹪酪素溶液的配制

0.5g酪素潤漲透明調pH=pH最適冷卻

100ml

0.5mol/L的NaOH0.1mol/L的HCL沸水浴pH=pH最適的緩沖溶液第46頁，共55頁，2023年，2月20日，星期四3．配制待測酶液0.5g酶粉研磨5`研磨5`攪拌沉降轉移清液研磨反復3-4次200ml

8層干沙布過濾吸取10ml濾液