諾如病毒感染性腹瀉樣品采集與檢測第1頁/共30頁■不同類型標本的采集要求■樣品采集、運輸和保藏■諾如病毒檢測方法及結果分析主要內容第2頁/共30頁原則

不同類型標本的采樣原則第3頁/共30頁一、病例根據初步流行病學調查的結果，盡量采集重點

病例：如首發病例/指示病例、住院病例、發病廚工、重點崗位的病例等的標本；疫情進展過程中，應選取各階段一定比例的現癥病例采集標本。第4頁/共30頁一、病例發病3天內的糞便（最好）帶便肛拭子或嘔吐物標本一式兩份（致病菌、病毒）病例數20例以下，全部采集

20例及以上，至少采集20例病例標本發病超過3天的和已痊愈病例可不采樣保存條件及登記樣本相關信息：姓名、性別、年齡，發病時間、采集時間等附件8和附表8-1第5頁/共30頁二、廚工食源性暴發溯源可采集廚工的糞便（最好）

或帶便肛拭子標本涉疫單位的廚工人數在30人以下，全部采樣；

30人及以上，盡量采集接觸直接入口食品崗位

的廚工：如參與蛤、牡蠣、貽貝等貝殼類海產

品加工，從事沙拉、涼菜、面包/糕點制作，

從事餐具清洗消毒及食品分發的廚工以及近期出現過胃腸不適癥狀的廚工，至少采集30人。第6頁/共30頁三、食品和水由于目前國家沒有食品和水中諾如病毒檢測的標準方法，食品和水等樣本的采

集和檢測工作根據實際情況確定。流行病學依據

第7頁/共30頁四、環境樣品可根據疫情調查需要采集各類場所

（如廚房、廁所等）的環境涂抹標本。第8頁/共30頁原則

樣品采集、運輸和保藏（附件8）第9頁/共30頁一、采樣對象與數量標本種類糞便（最好）帶便肛拭子和嘔吐物特殊情況時采集唾液用于人體易感性檢測可根據疫情調查需要采集食品、水及各類場所

（如廚房、廁所等）的環境涂抹樣品采樣數：病例數20例以下，全部采集

20例及以上，至少采集20例病例標本第10頁/共30頁二、采集要求糞便、帶便肛拭子和嘔吐物糞便可用便盒采集肛拭子用采樣棉簽蘸生理鹽水或病毒保存液、或PBS液

后，插入肛門4-5cm（幼兒2-3cm）處，輕輕旋轉擦取

直腸表面帶便粘液，置于含病毒保存液的采樣管中。嘔吐物可注入滅菌容器內采集的最優時間在發病后48-72小時內采集量3g/3ml左右采樣時，如發現手套被污染應及時更換，采樣容器外部

被污染時需獨立包裝，以避免樣品間的交叉污染。樣本采集后，立即冷藏保存。第11頁/共30頁唾液

用滅菌平皿或廣口容器留取1ml，或用棉拭子

沾兩頰黏膜及舌底擦拭留取。第12頁/共30頁食品將殘余食物用滅菌鑷子或匙采取，置于滅菌容器；

如無殘余食物，可用干凈拭子在盛放過可疑食物

的容器內涂擦，然后置于裝有2ml生理鹽水或病毒

保存液試管內。由于目前沒有標準檢測方法，暫時無法確定采集

量，可根據病毒的最低感染限、所用方法的最低

檢出限和可能的用量協商確定。第13頁/共30頁水用干凈無菌瓶采集疑似被污染的飲用水或生活

用水。由于目前沒有標準檢測方法，暫時無法確定采

集量，可根據病毒的最低感染限、所用方法的

最低檢出限和可能的用量協商確定。第14頁/共30頁環境涂抹標本可用無菌拭子涂擦，放入病毒保存液或PBS液

容器內。第15頁/共30頁三、標本運送與貯存標本采集后冷藏于10℃以下立即送檢，同時附

樣品送檢表（附表8-1）。標本在采集交送過程中盡量固定、防止泄漏，

如需長途運輸，應放在有密封圈的螺口管中；

注意防止交叉污染。如不能盡快開展檢測，應貯存在-20℃冰箱短

期保存。

第16頁/共30頁原則

諾如病毒檢測方法及結果分析第17頁/共30頁標本處理糞便流程如下圖。制成10%的便懸液后，立即檢測或置-20℃冰箱

保存備用。注意:便懸液如果過濃，可能導致提取的核酸中

抑制物過多，影響核酸檢測結果。第18頁/共30頁

標本處理（10%便懸液制備）0.1ml/0.1g糞便標本（固體豌豆粒大?。?00μlPBS漩渦振蕩器劇烈震蕩3次，每次15s4℃

≥

5000rpm離心5min或≥3000rpm離心30min室溫靜止10min10%便懸液上清第19頁/共30頁標本處理肛拭子和環境涂抹標本經漩渦振蕩器震蕩15秒后，吸上清立即檢測

或置-20℃冰箱保存備用。嘔吐物置于漩渦震蕩器充分混勻，4℃,≥5000r/min

離心5min，或≥3000r/min離心30min，吸上清，立即檢測或置-20℃冰箱保存備用。

第20頁/共30頁標本檢測——核酸檢測核酸提?。ǘ喾N商業試劑，如Qiagen、羅氏等）病毒RNA提取試劑（推薦）病毒總核酸提取試劑進行PCR實驗時，容易受到來自人、細菌等非

目標物種基因的影響，產生假陽性。核酸提取完成后，盡快放入冰箱，如果3天內檢測，10℃以下保存即可，否則放入-70℃冰箱保存。注意盡量不要讓核酸被環境中、手套上的細菌、灰塵中含有的RNA酶降解，也不要反復凍融。第21頁/共30頁核酸檢測熒光逆轉錄聚合酶鏈反應(real-timeRT-PCR)諾如病毒核酸檢測的首選方法，特異性和敏感性較高，出現假陽性的機率也遠低于傳統RT-PCR，但受病毒核酸變異影響較RT-PCR大。目前國內商業化的試劑可檢測GI和GII組病毒，但對于GⅣ組病毒的檢測效果還不清楚，有些試劑的GI組檢測效果也相對較差，因此如果檢測結果為陰性，不能完全排除該病毒感染。第22頁/共30頁核酸檢測逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）國際上常用檢測方法，準確、靈敏雖敏感性和特異性較real-timeRT-PCR方法低，但可以進行病毒基因型的分型測序研究，對于流行病學具有重要意義。注意事項：1.糞便中抑制PCR反應的成分多，可能造成假陰

性，可通過稀釋標本降低抑制物濃度來解決。

第23頁/共30頁2.由于諾如病毒基因變異大，目前還沒有一對引物能把所有基因型都檢測出來，這也可能造成假陰性結果。3.采用套式PCR方法可進一步提高檢測的靈敏度和特異性，但非常容易造成實驗室污染，因此操作時需做好防污染措施。第24頁/共30頁抗原檢測——酶鏈免疫法（ELISA）操作簡便、結果較穩定。在標本數量多、種類主要為糞便的暴發疫情檢測中可考慮使用此方法。由于病毒抗原制備復雜，病毒變異大，只能檢出與抗體同源或相近的病毒，因此對于某些型的病毒可能無法檢測到?，F有質量較好的試劑盒對于目前引起暴發的主要基因型一般可以檢出。由于糞便成分復雜，影響因素多，可能出現假陽性，應結合臨床癥狀和流行病學特征分析結果。第25頁/共30頁檢測結果分析

根據既往社區諾如病毒感染監測數據和近年諾如病毒感染暴發標本檢測情況等，對暴發疫情標本檢測結果提出以下分析供參考，同時需綜合考慮疫情現場流行病學調查結果等情況。第26頁/共30頁糞便標本：如果在非流行季節，諾如病毒檢出陽性率高于20%，可能為諾如病毒暴發；在流行季節，諾如病毒檢出陽性率高于40%，可能為諾如病毒暴發。肛拭子標本：如果在非流行季節，諾如病毒檢出陽性率高于20%，可能為諾如病毒暴發；在流行季節，諾如