（3）從原料起源是否豐富考慮；（4）從簡化提純步驟著手（5）如用動(dòng)物組織作原料，則此動(dòng)物宰殺后應(yīng)馬上取材。

從動(dòng)物或植物中提取酶受到原料限制，伴隨酶應(yīng)用日益廣泛和需求量增加，工業(yè)生產(chǎn)重點(diǎn)已逐步轉(zhuǎn)向微生物。用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)藥用酶，不受季節(jié)、氣候和地域限制，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，成本低，能大規(guī)模生產(chǎn)。酶類藥物的制備專家講座第1頁二、微生物酶制劑高產(chǎn)菌株選育

菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑主要條件。與增加品種、縮短生產(chǎn)周期、改進(jìn)發(fā)酵和提取工藝條件等親密相關(guān)。優(yōu)良菌種取得有三條路徑：①是從自然界分離篩選：②是用物理域化學(xué)方法處理、誘變；③是用基因重組與細(xì)胞融合技術(shù)。所以微生物分離篩選是一切工作基礎(chǔ)。酶類藥物的制備專家講座第2頁三、微生物酶制劑生產(chǎn)發(fā)酵技術(shù)

首先要合理選擇培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、pH和通氣量等。還要研究酶分離提純技術(shù)和制備工藝。（—）原料

利用微生物生產(chǎn)酶制劑主要原料為碳源和氮源，另外還有無機(jī)鹽、生長原因和產(chǎn)酶促進(jìn)劑等。酶類藥物的制備專家講座第3頁

假如添加少許某種物質(zhì)就能顯著增加酶產(chǎn)量時(shí)，這類物質(zhì)通稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑。它們大多屬于酶誘導(dǎo)物或表面活性劑。1、固體培養(yǎng)法

固體培養(yǎng)法亦稱麩曲培養(yǎng)法，該法是利用麩皮或米糠為主要原料，另外視需要添加其它谷糠、豆餅等，加水拌成含水適度半固態(tài)物料作為培養(yǎng)基。2、液體培養(yǎng)法

液體培養(yǎng)法是利用液體培養(yǎng)進(jìn)行微生物生長繁殖和產(chǎn)酶。依據(jù)通氣（供氧）方法不一樣，又分為液體表面培養(yǎng)和液體深層培養(yǎng)兩種。酶類藥物的制備專家講座第4頁3、影響酶產(chǎn)生一些原因

菌種產(chǎn)酶性能是決定發(fā)酵效果主要原因，不過發(fā)酵工藝條件對產(chǎn)酶影響也是十分顯著。（1）溫度普通發(fā)酵溫度比種子培養(yǎng)時(shí)略高些，這么對產(chǎn)酶有利。（2）pH可用糖或淀粉調(diào)整，pH低則可用氨來調(diào)整。酶類藥物的制備專家講座第5頁（3）通氣（供氧）臨界氧濃度。氧必須是溶解于培養(yǎng)基中氧。（4）攪拌增加液體湍流速度，降低氣泡周圍液膜厚度。有利于促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝。（5）泡沫和消沫劑因?yàn)榕囵B(yǎng)基中蛋白質(zhì)分子排在氣泡表面形成一層吸附膜，聚集成泡沫層之故。（6）添加誘導(dǎo)劑和抑制劑誘導(dǎo)酶誘導(dǎo)酶合成，誘導(dǎo)酶是該酶作用底物或者是其類似物。抑制劑促進(jìn)酶形成。加入適量表面活性劑。酶類藥物的制備專家講座第6頁二、酶類藥品提取和純化（一）生物材料預(yù)處理1、動(dòng)物材料預(yù)處理（1）機(jī)械處理

用絞肉機(jī)絞，普通細(xì)胞并不破碎。有酶必須細(xì)胞破碎后才能有效地提取，在試驗(yàn)室慣用是玻璃勻漿器和組織搗碎器。

（2）重復(fù)凍融

冷到-10℃左右，再遲緩溶解至室溫，如此重復(fù)屢次。因?yàn)榧?xì)胞中冰晶形成，及剩下液體中鹽濃度增高，能使細(xì)胞中顆粒及整個(gè)細(xì)胞破碎，從而使一些酶釋放出來。酶類藥物的制備專家講座第7頁（3）丙酮粉

組織經(jīng)丙酮快速脫水干燥制成丙酮粉，不但可降低酶變性，同時(shí)因細(xì)胞結(jié)組成份破碎使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合一些化學(xué)鍵打開，促使一些結(jié)合酶釋放到溶液中。慣用方法是將組織糜或勻漿懸浮于0.0lmol／L，pH6.5磷酸緩沖液中，在0℃下一邊攪拌，一邊漸漸倒入10倍體積-15℃無水丙酮內(nèi)，10min后，離心過濾取其沉淀物，重復(fù)用冷丙酮洗幾次，真空干燥即得丙酮粉。

丙酮粉在低溫下可保留多年。酶類藥物的制備專家講座第8頁2、微生物預(yù)處理

要是酶是胞外酶，則可除去菌體后再直接從發(fā)酵液中吸附提取酶。但對胞內(nèi)酶則需將菌體細(xì)胞破壁，制成無細(xì)胞懸液后再行提取。

菌體用生理鹽水洗滌除去培養(yǎng)基后，應(yīng)深凍保留。干燥法，因?yàn)楦稍锍Ｄ茉斐杉?xì)胞自溶，增加酶釋放，從而在后處理中破壁無須太猛烈就能到達(dá)預(yù)期目標(biāo)。（1）慣用干燥法有：①空氣干燥25～30℃②真空干燥還原劑作保護(hù)劑③冷凍干燥對較敏感酶宜用此法。（2）機(jī)械法：慣用方法有研磨法，組織勻漿法，超聲波法，高壓勻漿法等。酶類藥物的制備專家講座第9頁（3）酶法處理

用得最多是溶菌酶，如在37℃，pH8.0下對小球菌進(jìn)行破壁處理，歷時(shí)15分鐘，即可提取核酸酶。也有用脫氧核糖核酸酶處理，操作與溶菌酶同。（二）酶提取1、水溶液提取法

慣用稀鹽溶液或緩沖液提取。普通在低溫下操作。在酸性條件下穩(wěn)定酶要在酸性條件下提取。普通來說，堿性蛋白酶用酸性溶液提取，酸性蛋白酶用堿性溶液提取。酶類藥物的制備專家講座第10頁

鹽濃度普通以等滲為好，相當(dāng)于0.15mol／LNaCl離子強(qiáng)度是最適宜于酶提取。2、有機(jī)溶劑提取法

一些結(jié)合酶如微粒體和線粒體膜酶，因?yàn)楹椭|(zhì)牢靠結(jié)合，為此必須除去結(jié)合脂質(zhì)，且不能使酶變性，最慣用有機(jī)溶劑是丁醇。3、表面活性劑提取法

表面活性劑能與蛋白質(zhì)結(jié)含而分散在溶液中，故可用于提取結(jié)合酶。酶類藥物的制備專家講座第11頁4、酶制劑工業(yè)提取法(1)發(fā)酵液預(yù)處理及過濾微生物發(fā)酵液分離，過濾，發(fā)酵液中加絮凝劑或凝固劑。絮凝劑有聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷氨酸。(2)活性炭、脫色樹脂。(3)鹽析法用得最多是（NH4）2SO4，在常溫下不會(huì)造成酶失活，若分級(jí)沉淀應(yīng)用得當(dāng)，雜蛋白雜質(zhì)也較少。酶類藥物的制備專家講座第12頁5、有機(jī)溶劑法

有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)能力為丙酮＞異丙醇＞乙醇＞甲醇。工業(yè)上通常采取乙醇作為沉淀劑。6、噴霧干燥直接制備粉末酶制劑

噴霧干燥用于干燥菌體，藥用酶慣用冷凍干燥。

（三）酶純化

評(píng)價(jià)純化工藝主要看二個(gè)指標(biāo)，一是酶比活，二是總活力回收。

酶類藥物的制備專家講座第13頁酶在純化過程中一些技術(shù)難點(diǎn)：1、雜質(zhì)除去

酶提取液中，除所需酶外，還含有大量雜蛋白、多糖、脂類和核酸等。（1）pH和加熱沉淀法（2）蛋白質(zhì)表面變性法

利用蛋白質(zhì)表面變性性質(zhì)差異，也可除去雜蛋白，加入氯仿和乙醇進(jìn)行震蕩，能夠除去雜蛋白。酶類藥物的制備專家講座第14頁（3）選擇性變性法

利用蛋白質(zhì)穩(wěn)定性不一樣，除去雜蛋白。甚至可用2.5%三氯乙酸處理。（4）核酸沉淀劑法

用核酸酶，將核酸降解成核苷酸，使粘度下降便于離心分離。用核酸沉淀劑如三甲基十六烷基溴化銨、硫酸鏈霉素、聚乙烯亞胺、魚精蛋白和二氯化錳等。（5）將酶與底物結(jié)合

酶和底物結(jié)合或競爭性抑制劑結(jié)合后，熱穩(wěn)定性大大提升，這么就可用加熱法除去雜蛋白。酶類藥物的制備專家講座第15頁2、脫鹽和濃縮（1）脫鹽

脫鹽方法是透析和凝膠過濾。（2）濃縮

酶濃縮方法很多，有冷凍干燥、離子交換、超濾、凝膠吸水、聚乙二醇吸水等。3、酶結(jié)晶把酶提純到一定純度以后（通常純度應(yīng)達(dá)50%以上），可使其結(jié)晶，酶純度經(jīng)常有一定程度提升。為研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)提供X射線衍射樣品。酶類藥物的制備專家講座第16頁（1）酶結(jié)晶方法酶結(jié)晶方法主要是遲緩地改變酶蛋白溶解度，使其略處于過飽和狀態(tài)。①鹽析法：操作要在低溫下進(jìn)行，加鹽，緩沖液pH要靠近酶等電點(diǎn)。多數(shù)酶就可形成結(jié)晶。有時(shí)也可交替置在4℃冰箱中和室溫下來形成結(jié)晶。②有機(jī)溶劑法：酶液中滴加有機(jī)溶劑，有時(shí)也能使酶形成結(jié)晶。普通要含少許無機(jī)鹽情況下，選擇使酶穩(wěn)定pH，遲緩地滴加有機(jī)溶劑。使用緩沖液普通不用磷酸鹽，而用氯化物或乙酸鹽。酶類藥物的制備專家講座第17頁③復(fù)合結(jié)晶法：有時(shí)能夠利用一些酶與有機(jī)化合物或金屬離子形成復(fù)合物或鹽性質(zhì)來結(jié)晶。④透析平衡法

⑤等電點(diǎn)法

（2）結(jié)晶條件選擇①酶純度：酶純度越高，結(jié)晶越輕易，長成大單晶可能性也越大。結(jié)晶對酶有顯著純化作用。②酶濃度③溫度：結(jié)晶溫度通常在4℃下或室溫25℃下，低溫條件下酶不但溶解度低，而且不易變性。酶類藥物的制備專家講座第18頁④時(shí)間：結(jié)晶形成時(shí)間,數(shù)小時(shí)到幾個(gè)月，有甚至需要1年或更長時(shí)間。普通來說，較大而性能好結(jié)晶是在生長慢情況下得到。普通希望使微晶形成快些，然后慢慢地改變沉淀?xiàng)l件，再使微晶慢慢長大。

⑤pH：調(diào)整pH可使結(jié)晶長到最正確大小，也可改變晶形。結(jié)晶溶液pH普通選擇在被結(jié)晶酶等電點(diǎn)附近。⑥金屬離子：許多金屬離子能引發(fā)或有利于酶結(jié)晶，在酶結(jié)晶過程中慣用金屬離子有Ca2+、Zn2＋、Co2＋、Cu2＋、Mg2＋、Mn2＋、Ni2＋等。酶類藥物的制備專家講座第19頁⑦晶種：不易結(jié)晶蛋白質(zhì)和酶，有需加入微量晶種才能結(jié)晶，⑧結(jié)晶器皿處理：結(jié)晶用器皿要充分清洗、烘干。使用前用結(jié)晶母液再?zèng)_洗一次。結(jié)晶玻璃器皿，可用硅涂料進(jìn)行表面處理，以使表面光滑且不潤濕。這么可降低晶核數(shù)目，形成大結(jié)晶。4、酶分離和純化工作注意事項(xiàng)（1）預(yù)防酶蛋白變性（2）預(yù)防輔因子流失（3）預(yù)防酶被蛋白水解酶降解酶類藥物的制備專家講座第20頁

三、酶類藥品

（一）藥用酶類概述早期酶制劑主要用于治療消化道疾病，燒傷及感染引發(fā)炎癥疾病，現(xiàn)在國內(nèi)外己廣泛應(yīng)用于各種疾病治療，其制劑品種已超出700余種。1、促進(jìn)消化酶類

2、消炎酶類

3、與纖維蛋白溶解作用相關(guān)酶類4、抗腫瘤酶5、其它藥用酶酶類藥物的制備專家講座第21頁（二）胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）

胃蛋白酶廣泛存在于哺乳類動(dòng)物胃液中，藥用胃蛋白酶系從豬、牛、羊等家畜胃粘膜中提取。1、組成（結(jié)構(gòu)）、性質(zhì)藥用胃蛋白酶是胃液中各種蛋白水解酶混合物，含有胃蛋白酶、組織蛋白酶、膠原酶等，為粗制酶制劑。水溶液呈酸性，難溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。pI為pH1.0，最適pH1.5～2.0。可溶于70％乙醇和pH420％乙醇中。

胃蛋白酶能水解大多數(shù)天然蛋白質(zhì)底物。

酶類藥物的制備專家講座第22頁2、生產(chǎn)工藝（1）工藝路線：胃蛋白酶原鹽酸催化激活成胃蛋白酶。慣用脫脂劑有乙醚、氯仿、四氯化碳。酶類藥物的制備專家講座第23頁（2）胃膜素和胃蛋白酶聯(lián)產(chǎn)工藝：向經(jīng)消化、提取、脫脂、分層、濃縮及60％丙酮沉淀分離胃膜素母液中，邊攪拌邊加冷丙酮，至比重為0.91，即有淡黃色胃蛋白酶沉出，靜放過夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。（3）結(jié)晶胃蛋白酶制備：藥用胃蛋白酶原粉，溶于20％酒精中，加H2SO4調(diào)pH3.0，5℃靜置20h后過濾，加硫酸鎂至飽和，進(jìn)行鹽析。鹽析物再在pH3.8～4.0乙醇中溶解，過濾，濾液用硫酸調(diào)pH至1.8～2.0，即析出針狀胃蛋白酶。沉淀再溶于20%pH4乙醇中，過濾，濾液用硫酸調(diào)pH至1.8，在20℃放置，可得板狀或針狀結(jié)晶。酶類藥物的制備專家講座第24頁（三）胰蛋白酶

胰蛋白酶是從牛、羊胰臟提取、結(jié)晶凍干制劑。易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。在pH1.8時(shí)，短時(shí)煮沸幾乎不失活；在堿溶液中加熱則變性沉淀，Ca2+有保護(hù)和激活作用，胰蛋白酶pI為10.1。牛胰蛋白酶在腸激酶或本身催化下，釋放出6肽，變成有活性胰蛋白酶。胰蛋白酶分子量24000，由223個(gè)氨基酸殘基組成。胰蛋白酶專一作用于由堿性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所組成肽鍵。酶本身很輕易自溶。酶類藥物的制備專家講座第25頁2、生產(chǎn)工藝（1）工藝路線：酶類藥物的制備專家講座第26頁（四）糜蛋白酶（Chymotrypsin，EC3.4.4.5）胰蛋白酶可激活糜蛋白酶原成α-糜蛋白酶。2、生產(chǎn)工藝酶類藥物的制備專家講座第27頁（五）尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26）

尿激酶，是一個(gè)堿性蛋白酶。由腎臟產(chǎn)生，主要存在于人及哺乳動(dòng)物尿中。人尿平均含量5～6國際單位／m1。1、組成（結(jié)構(gòu)）性質(zhì)（1）尿激酶有各種分子量形式。尿中尿胃蛋白酶原，在酸性條件下能夠激活生成尿胃蛋白酶，把天然尿激酶降解成為尿激酶。（2）尿激酶是專一性很強(qiáng)蛋白水解酶，血纖維蛋白溶酶原是它唯一天然蛋白質(zhì)底物，它作用于精氨酸-纈氨酸鍵使纖溶酶原轉(zhuǎn)為纖溶酶。尿激酶也含有酯酶活力。酶類藥物的制備專家講座第28頁（3）尿激酶pI為pH8～9，主要部分在pH8.6左右。溶液狀態(tài)不穩(wěn)定，凍干狀態(tài)可穩(wěn)定多年。加入1％EDTA、人血白蛋白或明膠可預(yù)防酶表面變性作用。2、生產(chǎn)工藝（1）工藝路線：酶類藥物的制備專家講座第29頁（2）工藝過程：硅藻土吸附，0.02％氨水加0.1mol／L氯化鈉洗脫。QAE—Sephadex層析柱去熱原、色素。CM—C濃縮。酶類藥物的制備專家講座第30頁（六）溶菌酶（Lysozyme）溶菌酶，又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶。它廣泛存在于鳥類和家禽蛋清、哺乳動(dòng)物淚、唾液、血漿、尿、乳汁、白細(xì)胞和組織（如肝、腎）細(xì)胞內(nèi)，其中以蛋清含量最豐富。溶菌酶是一個(gè)含有殺菌作用天然抗感染物質(zhì)，含有抗菌、抗病毒、抗炎癥。1、組成（結(jié)構(gòu)）和性質(zhì)溶菌酶是一堿性球蛋白，分子中堿性氨基酸、酰氨殘基及芳香族氨基酸（如色氨酸）百分比很高。酶類藥物的制備專家講座第31頁溶菌酶能催化粘多糖或甲殼素中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間β-1，4糖苷鍵。溶菌酶是一個(gè)罕見穩(wěn)定蛋白質(zhì)。在pH5.5加熱4h后，酶變得更活潑。低濃度Mn（10-7mol／L）在中性和堿性條件下能使酶免受熱失活作用。酶類藥物的制備專家講座第32頁2、生產(chǎn)工藝（1）工藝路線酶類藥物的制備專家講座第33頁（七）超氧化物歧化酶（SuperoxidedismutaseSOD）

超氧化物歧化酶是一個(gè)主要氧自由基去除劑，作為藥用酶在美國、德國、澳大利亞等國有產(chǎn)品，此酶屬金屬酶，它催化化學(xué)反應(yīng)是：因?yàn)镾OD能專一去除超氧陰離子自由基（O2-）；故引發(fā)國內(nèi)外生化界和醫(yī)藥界極大關(guān)注。當(dāng)