RNA指導(dǎo)的DNA復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄及病毒的復(fù)制現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscription)

1964年，Temin發(fā)現(xiàn)Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制劑遏制。表明：RNA腫瘤病毒的RNA復(fù)制過(guò)程中要合成DNA。Temin又發(fā)現(xiàn)放線菌素D能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，但不能抑制一般RNA病毒的復(fù)制。表明：轉(zhuǎn)錄對(duì)于RNA病毒增殖是必需的。現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一Temin提出前病毒假說(shuō)：原病毒DNA是RNA腫瘤病毒在復(fù)制和致癌中的中間物。1970年，Temin在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶。現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一多功能酶：

1、RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解RNA-DNA雜交體上的RNA3、DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：合成互補(bǔ)DNA。4、沒有3`→5`外切酶活性。現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一特點(diǎn)：

含有Zn2+（是否有鋅指結(jié)構(gòu)、DNA結(jié)合功能？）DNA合成反應(yīng)要求有模板和引物。需適當(dāng)濃度的二價(jià)陽(yáng)離子（Mg2+、Mn2+）5’→3’合成方向→現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因

組復(fù)制過(guò)程第一階段：合成負(fù)股cDNA的大部分第二階段：以負(fù)股DNA為模板合成一小部分正股DNA鏈。第三階段：完成cDNA的全部復(fù)制。現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一乙肝病毒基因組的復(fù)制其復(fù)制需通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程經(jīng)RNA中間體實(shí)現(xiàn)，其DNA聚合酶也是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一逆轉(zhuǎn)錄病毒：RNA→DNA→RNA乙肝病毒：DNA→RNA→DNA現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一試管內(nèi)cDNA的合成常用于獲得或研究真核生物基因的方法。提取某一種特定的mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA可代表某一特定基因。常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：來(lái)自鳥類成髓細(xì)胞瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒稱為AMV-RT；來(lái)自鼠白血病毒稱為MMLV-RT。現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一病毒RNA復(fù)制的主要方式1、病毒含有正鏈RNA，如灰質(zhì)炎病毒。RNA（+）→蛋白質(zhì)（酶）→RNA復(fù)制2、病毒含有負(fù)鏈RNA和復(fù)制酶如狂犬病毒。RNA（-）→RNA（+）→蛋白質(zhì)、復(fù)制病毒RNA（-）。3、病毒含有雙鏈RNA和復(fù)制酶。如呼腸孤病毒。雙鏈RNA→RNA（+）→蛋白質(zhì)→RNA（-）→雙鏈RNA4、逆轉(zhuǎn)錄病毒。現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一討論題如何知道DNA復(fù)制中先要有RNA引物的合成？(原料/新合成DNA序列分析/專一核酸酶水解)現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一病毒的復(fù)制

病毒在活細(xì)胞內(nèi)，以其基因?yàn)槟０澹诿傅淖饔孟拢謩e合成病毒基因及蛋白質(zhì)，再組裝成完整的病毒顆粒，這種方式稱為復(fù)制（replication)。從病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞開始，經(jīng)過(guò)基因組復(fù)制和病毒蛋白合成，至釋放出子代病毒的全過(guò)程，稱為一個(gè)復(fù)制周期。病毒的復(fù)制周期主要包括吸附和穿入、脫殼、生物合成、組裝和釋放四個(gè)連續(xù)步驟。現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一復(fù)制周期現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一病毒的一步生長(zhǎng)曲線病毒的一步生長(zhǎng)曲線：以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，病毒效價(jià)為縱坐標(biāo)，繪制出的病毒特征曲線。現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一一、吸附和穿入（一）吸附(adsorption)分兩個(gè)階段：靜電吸附：病毒體與細(xì)胞接觸，進(jìn)行靜電結(jié)合。非特異性、可逆。真正的吸附：病毒體表面位點(diǎn)（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)）與宿主細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合。是決定病毒感染的真正開始。現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一裸露病毒的吸附

現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一囊膜病毒的吸附

現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一（二）穿入(penetration)

病毒體吸附在宿主細(xì)胞膜上后，可通過(guò)數(shù)種穿入方式進(jìn)入細(xì)胞：1.無(wú)囊膜的病毒

一般經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜吞入，稱為病毒胞飲,如腺病毒、小RNA病毒等現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一病毒胞飲現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一2.有囊膜的病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合，病毒的核衣殼直接進(jìn)入細(xì)胞漿內(nèi)病毒胞飲:細(xì)胞膜吞入現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一(1)膜融合后進(jìn)入現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一(2)

病毒胞飲現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一二、脫殼(uncoating)

不同病毒脫殼方式不一，多數(shù)在宿主細(xì)胞溶酶體酶作用下脫殼，釋放出基因組核酸。現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一三、生物合成(biosynthesis)病毒基因組一旦從衣殼中釋放后，就利用宿主細(xì)胞提供的低分子物質(zhì)合成大量的病毒核酸和結(jié)構(gòu)蛋白。早期，根據(jù)病毒基因組轉(zhuǎn)錄成mRNA、指令合成轉(zhuǎn)錄合成所必需的復(fù)制酶和一些抑制蛋白；生物合成階段，病毒處于隱蔽期病毒的生物合成過(guò)程可基本歸為6大類：雙股DNA病毒、單股DNA病毒、單正股RNA病毒、單負(fù)股RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和雙股RNA病毒。

現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一病毒DNA早期mRNA早期蛋白（酶等）子代病毒DNA晚期mRNA病毒結(jié)構(gòu)蛋白子代病毒子雙股DNA病毒復(fù)制宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄酶現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一單鏈正股RNA病毒（-）ssRNA親代病毒（+）ssRNA早期蛋白（+）ssRNAdsRNA復(fù)制中間型（-）ssRNA（+）ssRNA大量子代（+）ssRNA晚期蛋白裝配子代病毒現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一單股負(fù)股RNA病毒病毒自身攜帶依賴RNA的RNA多聚酶。親代（-ssRNA）（+）mRNA蛋白質(zhì)（+）ssRNA子代（-）sRNA子代病毒多聚酶現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙股DNA整合至宿主細(xì)胞（前病毒）mRNA病毒RNA結(jié)構(gòu)蛋白裝配子代病毒RNA:DNA轉(zhuǎn)錄酶聚合酶現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一四、組裝病毒核酸與衣殼裝配在一起，形成病毒子。絕大多數(shù)DNA病毒均在細(xì)胞核內(nèi)組裝;RNA病毒和痘病毒在細(xì)胞漿內(nèi)組裝。現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一絕大多數(shù)無(wú)囊膜病毒釋放，一次同步，破壞宿主細(xì)胞膜，細(xì)胞裂解釋放病毒顆粒，細(xì)胞迅速死亡。絕大多數(shù)有囊膜病毒以出芽方式釋出時(shí)包上細(xì)胞核膜或細(xì)胞膜而成為成熟病毒。逐個(gè)釋出，非一次同步，細(xì)胞死亡緩慢。五、釋放現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一VirusObtainingItsEnvelopefromHostCellMembranebyBudding

現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一復(fù)制周期現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一思考題1某種病毒DNA的堿基組成（摩爾百分比）如下：

A=32；G=16；T=40；C=12

該病毒DNA的特點(diǎn)如何？現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一思考題2簡(jiǎn)要說(shuō)明怎樣進(jìn)行構(gòu)建cDNA文庫(kù)？現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有42頁(yè)\編輯于星期一思考題3組織培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞S期長(zhǎng)達(dá)5小時(shí)，經(jīng)放射自顯影測(cè)定DNA復(fù)制的速度是