藥品分析方法驗證培訓第1頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二內容分析方法驗證的法規要求。ICH、USP、ChP和EP的方法驗證分析方法驗證的要求分析方法驗證的步驟分析方法驗證成功的前提分析方法驗證的要點含量分析方法驗證接受標準方法確認和方法傳遞第2頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二分析方法驗證的法規要求FDAcGMP[21CFR2411]—TestMethod,whichareusedforassessingcomplianceofpharmaceuticalarticleswithestablishdespecifications,mustmeetproperstandardsofaccuracyandreliability中國GMP(2010)、中國藥典非常關注驗證的過程，分析方法驗證不完善是常見的問題藥品質量標準中分析方法必須驗證藥物生產工藝變更、制劑的組分變更、原分析方法修訂時，則質量標準分析方法必須進行驗證EUGMPVolume4—analyticalmethodshallbevalidated,alltestingoperationsdescribedinthemarketingauthorisationshouldbecarriedoutaccordingtotheapprovedmethod.第3頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二分析方法驗證的法規要求采用新的檢驗方法檢驗方法需要變更的采用中國藥典未收載的檢驗方法法規規定的其他需要驗證的檢驗方法—對不需要進行驗證的檢驗方法，企業應進行方法確認，以保證檢驗數據準確、可靠。2015版藥典中分析方法驗證指導原則中國GMP（2010）對分析方法驗證規定：—符合下列情形之一的應對分析方法進行驗證2010版藥典中分析方法驗證指導原則只規定了項目和基本方法而沒有合格標準，ICH和USP類似。第4頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二ICH、USP、CP和EP中的方法驗證ICHQ2(R1)：Validationofanalyticalprocedures:TextandMethodology—2005/11ICHQ2A：TextonValidationofanalyticalprocedure(ParentGuideline)--1994/10ICHQ2B：Validationofanalyticalprocedure：Methodology(DeveloptocomplementtheParentguideline)—1996/11USP<1225>ValidationofcompendialProcedureEuropeanDirectoratefortheQualityofMedicines&Healthcare[PA/PH/OMCL(05)47DEF]Validationofanalyticalprocedure—2005/06第5頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二分析方法驗證的要求目的：證明所用的分析方法適用于相應的檢測要求需驗證的分析項目：鑒別試驗雜質定量或限度檢查，原料或制劑中有效成分含量測定制劑中其他成分（降解產物、防腐劑）的測定溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等的測試方法第6頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二分析方法驗證的要求驗證內容：準確度精密度專屬性檢測限定量限線性范圍耐用性第7頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二準確度精密度××××××××××××××第8頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二準確度（Accuracy）準確度是指該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率表示測定回收率R（recovery）的具體方法一般采用回收試驗法和加樣回收法進行數據要求：規定范圍內，至少用9次測定結果評價，如制備高、中、低三個不同濃度樣品各測三次第9頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二準確度（Accuracy）回收試驗法：空白+已知量A的對照品測定，測定值為M回收率計算公式：加樣回收法：在已準確測定藥物含量P的真實樣品+已知量A的對照品（或標準品）測定，測定值為M回收率計算公式：第10頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二含量測定方法的準確度（Accuracy）原料藥：可用已知純度的對照品或樣品進行測定或用本法所得結果與已建立準確度的另一方法測定的結果進行比較制劑：可用已知量被測物的各組分混合物進行測定，即采用在空白輔料中加入原料藥對照品的方法，如不能得到制劑的全部組分，可向制劑中加入已知量的被測物進行測定，或與另一個已建立準確度的方法比較結果第11頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二精密度（Precision）精密度：是指在規定條件下，同一個均勻樣品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度。用偏差(d)、標準偏差(SD)、相對標準偏差(RSD)(變異系數，CV)表示計算公式：第12頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二精密度（Precision）重復性（repeatability）：在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度：將同一份供試品溶液重復測定6次，計算相對標準偏差。由一位分析人員將同一均勻樣品重復稱樣制備供試品溶液6份，每份測定一次，計算相對標準偏差，即得。把被測物濃度當做100%，至少測6次進行評價第13頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二精密度（Precision）重現性（Reproducibility）：不同實驗室，不同分析人員測定結果的精密度：在不同實驗室由兩位檢驗人員將同一均勻樣品分別重復稱樣制備供試品溶液六份，每份測定一次，分別計算平均值及相對標準偏差，即得。設計中間精密度試驗應該注意的事情：

樣本量人員設備時間把被測物濃度當做100%，至少測6次進行評價第14頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二精密度（Precision）重現性（Reproducibility）：不同實驗室，不同分析人員測定結果的精密度：在不同實驗室由兩位檢驗人員將同一均勻樣品分別重復稱樣制備供試品溶液六份，每份測定一次，分別計算平均值及相對標準偏差，即得。此項方法僅用于方法傳遞

數據要求：需報告SD、RSD和置信區間第15頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二專屬性（Specificity）專屬性：指有其他成分（雜質、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準確測定出被測物的特性，能反映該方法在有共存物時對供試物準確而專屬的測定能力，是指該法用于復雜樣品分析時是否受到相互干擾程度的度量通常是通過分析含有加了雜質、降解產物、有關化學物質或安慰劑成分的樣品，將所獲分析結果與未加前述成分之樣品的測試結果比較，兩組測試結果之差即為專屬性根據方法規定，同條件下測定普通空白樣，特殊條件空白樣（如設定：普通空白樣在60℃條件下放置兩周）、對照品、標準樣品、可能的雜質、降解產物等，對照測定結果，良好的專屬性應表現為其他各種組分均不干擾被測物的測定。如在液相色譜圖譜中，普通空白樣、特殊條件空白樣、有關物質、內標、被測物對照品均應得到良好分離，如方法同時用于有關物質限度的測定，則要求各有關物質峰和可能存在的空白干擾峰均應完全分離，互不干擾。第16頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二專屬性（Specificity）鑒別反應：應能與可能共存的物質或結構相似化合物區別，不含被分析樣品，以及結構相似或組分中的有關化合物，均應成負反應。含量測定與雜質測定：色譜法和其他方法，應附典型圖譜，亦說明專屬性。圖中應標明各組分的位置，色譜法中的分離度應符合要求。雜質可獲得的情況下，對于含量測試，試樣中可加入雜質或輔料，考察測試結果是否受干擾；對于雜質測定，也可向試樣中加入一定量的雜質，考察雜質間是否得到分離；反之則需用其他方法進行比較。色譜峰純度試驗（二極管陣列、質譜）。第17頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二檢測限（DetectionLimitLOD）檢測限是指試樣在確定的實驗條件下，被測物能被檢測出的最低濃度或含量。他是限度檢驗效能指標，無需定量測定，只要指出高于或低于該規定濃度即可。非儀器目視法：用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量信噪比法：用于能顯示基線噪音的分析方法（儀器分析方法）是把已知濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的最低濃度或量，算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比3:1或2:1時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。標準差法：—測定背景10次以上，求出標注差σ

—將σ乘以3倍—在工作曲線上求出3σ相對應的濃度X；即為檢限—將求得的對應濃度值加上空白值（空白值為零則不加），即得檢出限第18頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二定量限（QuantitationLimitLOQ）定量限是指試樣在確定的實驗條件下，被測物能被定量測定最低濃度或含量。結果具有一定的準確度和精密度的要求。非儀器目視法：用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的符合準確度和精密度要求的最低濃度或量。信噪比法：一般以信噪比10:1時相應濃度或注入儀器的量確定定量限，也可以用儀器所測空白背景響應標準差（SD）的10倍為估計值，再經試驗確定方法的實際測定下限。第19頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二線性（Linearity）線性是指在設計范圍內，測試結果與試樣中被測物濃度直接呈正比關系的程度。也是證明被測物的濃度和檢測器響應的線性關系，必須制備不少于5種濃度，包括50%、100%150%，線性在分析方法的范圍內進行。評價。線性關系應以信號對被分析物的濃度或含量作圖，根據圖形是否呈線性進行評價，再用最小二乘法處理數據求得回歸曲線的斜率來表示。必要時可對響應信號進行數學轉換數據要求：至少需要五個濃度考察線性，需提供相關系數，截距，回歸斜率及方差等參數，應列出回歸方程和線性圖第20頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二范圍（Range）范圍：是指達到一定的精確度、準確度和線性的條件下，測試方法適用的高、低限濃度或量的區間。范圍應根據分析方法的具體應用和線性、準確度、精密度結果和要求確定。原料藥和制劑含量測定范圍為80%～120%；制劑含量均勻度范圍為70%～130%；雜質測定應為被測雜質報告值到限度的120%溶出度應為測定范圍的±20，如規定了限度范圍，應為下限的-20%至上線的+20%第21頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二耐用性（Robustness）耐用性：又稱粗放度，是指測定條件稍有變動時，結果不受影響的承受程度，為常規檢驗提供依據，是衡量實驗室和工作人員之間在正常情況下試驗結果重現性的尺度；如果方法易受到分析條件的影響或要求苛刻，應注明。典型的變動包括：

-分析溶液的穩定性用不同時間段的樣品和標準品溶液與新制的標準品溶液的對比結果來分析溶液的穩定性第22頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二耐用性（Robustness）-液相色譜的典型變動流動相pH（±0.5）流動相組成（有機相±5%）色譜柱溫度（±5℃）檢測波長（±5nm）氣相色譜的典型變動色譜柱同廠家溫度流速第23頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二檢驗項目和驗證內容總結中國藥典鑒別雜質定量測定雜質限度測定含量溶出度等校正因子準確度－√－√√√精密度-重復性－√－√√√精密度-中間精密度－√－√√√專屬性√√√√√√檢測限－－√－－－定量限－√－－－√線性－√－√√√范圍－√－√√√耐用性√√√√√√第24頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二檢驗項目和驗證內容總結USP鑒別雜質定量測定雜質限度測定含量溶出度等準確度－√*√*精密度-重復性－√－√√精密度-中間精密度－√－√√專屬性√√√√*檢測限－－√－*定量限－√－－*線性－√－√*范圍－√*√*第25頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二分析方法驗證步驟預驗證驗證方案的制定-驗證目的、背景-驗證設施、試劑、對照品、樣品信息-待驗證的方法、項目、可接受標準-實施人員和計劃-實施人員及培訓-參考文獻驗證實施收集完整的驗證過程記錄和原始圖譜數據和記錄的復核驗證結果的評估根據驗證報告制定檢驗標準第26頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二分析方法驗證注意要點預驗證：預驗證是指在正式驗證之前進行的試驗，目的是收集證據，以初步證實該檢驗方法可以達到預期要求，同時確定各個項目的可接受標準。空白樣：空白樣是指根據樣品的特性、配方和工藝過程，制備除了不含被測物外其他組成與樣品完全一致的模擬樣品。取樣效率:取樣效率僅用于清潔驗證所用檢驗方法的驗證，是指用棉簽或特定溶劑從設備表面獲取的被測物的量與設備表面被測物的實際含量接近的程度，以回收率（%）表示。第27頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二含量測定方法驗證的可接受標準準確度：各濃度下的平均回收率均應在98%～102%之間。9個回收率數據的相對標準偏差（RSD）應不大于2.0%精密度：—重復性：6份供試品液含量的相對標準偏差應不大于2.0%—中間精密度：12個含量數據相對標準偏差應不大于2.0%檢測限：主峰與噪音峰信號的強度比應不得小于3定量限：主峰與噪音峰信號的強度比應不得小于10第28頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二含量測定方法驗證的可接受標準線性：回歸線的相關系數應不得小于0.998，Y軸截距應在100%響應值的2%以內，相應因子的相對標準偏差應不大于2.0%耐用性：主峰拖尾因子不得大于2.0，主峰與雜質峰必須達到基線分離，各條件下的含量數據（n=6）的相對標準偏差應不大于2.0%系統適應性：主峰峰面積的相對標準偏差應不大于2.0%，主峰保留時間的相對標準偏差應不大于1.0%，另外主峰拖尾因子不得大于2.0，主峰與雜質峰必須達到基線分離，主峰理論塔板數應符合質量標準的規定。第29頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二分析方法確認方法確認是一種簡化了的方法驗證，目的是為了確認藥典方法或其他方法是否適用于實際使用環境。各國藥典和行業法規收載的檢驗方法。從外部引入的已經驗證的檢驗方法。以往老品種的檢驗方法，原廠無力或無法進行方法傳送。方法確認一般應進行準確度、重復性、專屬性的測試第30頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二如何對不需要驗證的檢驗方法做確認方法確認是一種簡化了的方法驗證，對不需要進行驗證的檢驗方法以及藥典方法和其他已驗證的法定方法，通過方法確認來證明在本實驗室條件下的適用性。方法確認方法確認一般應進行準確度、重復性、專屬性的測試，操作及限度要求同方法驗證。對于特殊檢驗方法，確認項目及限度可作適當調整，以確認方案為準。第31頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二如何對不需要驗證的檢驗方法做確認法定來源的檢驗方法已經過法定機構的方法驗證，方法本身的可靠性準確性已得到確認，以含量為例，一般應確認準確度，系統重復性，分析重復性、專屬性。確認目的：1.確認你的產品是否適應這個檢查方法，尤其是制劑處方中的輔料是否對檢查結果有干擾。2.確認你的實驗室的條件是否用這個檢測方法獲得準確的結果，包括儀器、設備、環境、人員等方面。第32頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二哪些檢驗項目不需要做方法確認

物理量檢查（pH、熔點、相對密度、粘度、顏色）-其基本理論已經多方驗證，所以無需在驗證、確認或傳送，但必須保證測定值在所用儀器的量程范圍內，儀器必須定期校驗且校驗結果符合要求。

如果已使用多年的檢驗方法能確保檢驗數據的準確性、可靠性，不需要再補充確認。其他如干燥失重、炙灼殘渣等實驗室日常測試步驟不需方法確認。第33頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二分析方法轉移

分析方法轉移是指一方將已經驗證的方法轉移給另一方的過程。

分析方法轉移主要進行不同實驗室在一定時限內對同一份樣品的重現性測試的結果對比。第34頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二微生物分析方法驗證

驗證目的：滿足法規要求的基礎上，保證檢驗結果的準確性和有效性，確保產品及檢驗環境等符合相應的標準要求

微生物方法驗證內容：無菌制劑微生物檢測方法驗證非無菌制劑微生物檢測方法驗證防腐劑效能試驗方法驗證消毒劑效力測試方法驗證環境檢測方法驗證清潔驗證時微生物檢測方法有效性驗證第35頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二分析方法驗證成功的前提經過培訓的人儀器已經驗證確認，校準并在校準有效期內可靠穩定的對照品第36頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二分析方法驗證成功的前提

按法規指導原則制定分析方法驗證方案清晰的描述了各項驗證的實驗制定了各項驗證實驗的可接受標準分析方法驗證方案已經經過批準在驗證過程中，沒有驗證偏離，如果需要改變驗證過程需要執行變更程序。所用的樣品和試劑、數據都是真實的和符合要求的第37頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二影響因素試驗強降解試驗條件熱：視各原料藥的熔點，不應超過100℃，多選用40℃和60℃，降解時間一般不少于24小時熱和濕：多選用40℃75%和60℃75%，降解時間一般不少于7天按ICH光照條件要求，視光照箱輻射能力而定時間，達到1.2﹡106lx或紫外光200瓦小時/平方米的條件第38頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二影響因素試驗強降解試驗條件氧化：1%至3%的雙氧水，在30℃,1～24小時酸降解：0.01mol/L至0.1mol/L鹽酸，在30℃,時間視分解程度而異堿性水解：0.01mol/L至0.1mol/L氫氧化鈉，在30℃,時間視分解程度而異經酸堿破壞的樣品需經中和后方可進行試驗第39頁，共45頁，2023年，2月20日，星期二影響