FAQ:引物的合成和純化.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺丫三酯法。該方法具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。主要是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核甘酸通過3'f5'磷酸二酯鍵連接。固相亞磷酰胺三酯法合成引物的具體步驟如下：1）將預先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核甘酸與三氯乙酸反應，脫去其5'-羥基的保護基團DMT,獲得游離的5'-羥基。2）合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核甘酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核昔亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5'-羥基發生縮合反應。3）帶帽（capping）反應，縮合反應中可能有極少數5'-羥基沒有參加反應（少于2%）,用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續發生反應，這種短片段可以在純化時分離掉。4）在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉變為更穩定的磷酸三酯。經過以上四個步驟，一個脫氧核甘酸被連接到固相載體的核甘酸上。再以三氯乙酸脫去它的5'-羥基上的保護基團DMT,重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過RPC、PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮，脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測定0D260定量，根據定單要求分裝。.DNA合成粗產物中含有什么雜質？

主要是合成反應過程中產生的失敗片段以及脫保護基團時產生的銨鹽。.引物純化方式有哪些?引物常用的純化方式C18脫鹽、RPC純化、PAGE純化、HPLC純化。純化方式詳細說明C18柱脫鹽又稱為簡易反相柱，對DNA有特異性吸附，可被有機溶液洗脫，但不會被水洗脫，因此能有效地去除鹽分，但不能有效去除比目的片段短的小片段。該方法一般不會對普通PCR反應產生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。RPC純化RPC純化是通過反相凈化濾芯(ReversePhaseCartridge)對引物進行純化，純化原理與反相HPLC純化一樣。與反相HPLC比較，RPC是一種有效并且更加經濟的純化方式。反相凈化濾芯通常包含一種疏水基質如C18的硅膠，能夠很好的吸附DNA，并且可以用水輕松地將切割下來的保護基團和短的引物片段從反相柱上洗掉。RPC純化的引物可以應用于DNA測序、PCR及基因合成等。PAGE純化PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對引物DNA進行分離，然后從凝膠中回收目的DNA。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于90%，對長鏈OligoDNA(大于50mer)的純化特別有效。HPLC純化HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對引物DNA進行純化。該方法用于分離純化或分析時能達到很高的純度和靈敏度。在引物DNA的分析和純化中，常用的有離子交換(ion-exchange)HPLC和反相(reverse-phase)HPLC。reversephaseHPLC：純度大于90%；ionexchangeHPLC：純度大于95%，可以有效的去除N-1短片段。HPLC純化主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的缺點是成本較高，批量生產效率不高。.引物純化方式如何選擇?引物純化主要方法的適用范圍及建議您可以根據您的實驗需求，選擇合適的金斯瑞引物純化方式，更加經濟方便。如果您需要進一步的指導，請聯系金斯瑞技術支持。

合成的引物5’端為羥基，沒有磷酸基團。如果需要，您可以用多核甘酸激酶進行5'端磷酸化，或者要求我們合成時直接在5'或3'端進行磷酸化，需要另外收費。.最長可以合成多長的引物？引物越長，出現問題的概率就越大。除非有特殊需要，我們建議合成片段長度不要超過800?廠,按照目前的引物合成效率，80mer的粗產品，全長引物的百分比不會超過40%，后續處理還會丟失很多，因此最后的產量很低。金斯瑞最長可合成110base的引物。.為何長鏈引物的收費要比短鏈引物要高？在合成長鏈引物時，所需要的試劑比短鏈引物要多，尤其是長度大于90base的引物。由于成本的增加，從而導致價格較高。.交付引物質量好壞的判斷標準是什么？合成的引物和您的定單序列一致，而不是能否擴增出您所需要的產物。.PCR產物經過克隆以后測序發現引物區與合成序列不相符合，怎么辦？多數情況是PCR過程和克隆過程中引入的錯誤。遇到這種情況，請您1）重新挑取克隆測序，會有找到正確克隆的可能2）可以要求我們重新免費合成引物。10.測序發現引物有突變是怎么回事？引物合成是一種多步驟的化學反應，每一步的合成效率最高也就是99%，副產品不可以避免。鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。在您PCR擴增后克隆測序的時候，為了節約時間和提高成功率，我們有如下建議：1）請您在檢測到陽性克隆后準備2~3個陽性克隆子的菌液，盡量送測2個或以上克隆，這樣成功率將大大提高，也節約很多時間；2）也可以先送測1個克隆，其余兩個克隆子的菌液在冰箱4度保存，一旦出現個別點突變或缺失，立即將余下的兩個克隆送測；3）這樣得到正確的序列