考馬斯亮藍法法測定蛋白質含量演示文稿現在是1頁\一共有20頁\編輯于星期四（優選）考馬斯亮藍法法測定蛋白質含量現在是2頁\一共有20頁\編輯于星期四【實驗原理】

考馬斯亮藍G250測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。考馬斯亮藍G250在酸性溶液中呈棕紅色，最大吸收峰在465nm；當它與蛋白質通過范德華鍵結合成復合物時變為藍色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系數更大。現在是3頁\一共有20頁\編輯于星期四考馬斯亮藍G-250在游離狀態下呈紅色，最大光吸收在465nm；當它與蛋白質結合后變為青色，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比。現在是4頁\一共有20頁\編輯于星期四蛋白質與考馬斯亮藍G250的結合十分迅速，約2min即可反應完全，其復合物在1h內保持穩定。現在是5頁\一共有20頁\編輯于星期四考馬斯亮藍R250與蛋白質反應雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條帶染色。現在是6頁\一共有20頁\編輯于星期四在一定蛋白質濃度范圍內(1～1000μg/ml）,蛋白質－染料復合物在595nm處的光吸收與蛋白質含量成正比，故可用于蛋白質的定量測定。

現在是7頁\一共有20頁\編輯于星期四由于蛋白質－染料復合物具有很高的消光系數，因此大大提高了蛋白質測定的靈敏度（最低檢出量為1μg）。現在是8頁\一共有20頁\編輯于星期四【器材與試劑】（一）器材1.可見光分光光度計2.刻度移液管3.移液槍（二）試劑1.NaCl（0.15mol/L）2.考馬斯亮藍試劑3.蛋白質標準液（1mg/mL）4.待測蛋白質溶液現在是9頁\一共有20頁\編輯于星期四試管編號0123456待測標準蛋白溶液（mL）00.020.030.040.050.060.100.15mol/LNaCl（mL）0.100.080.070.060.050.040考馬斯亮藍試劑（mL）5555555搖勻，1h內以0號管為空白對照，在595nm處比色A595nm0？？？？？？現在是10頁\一共有20頁\編輯于星期四1.如黑板上表格操作2.繪制標準曲線：以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。3.算出待測蛋白質濃度？現在是11頁\一共有20頁\編輯于星期四【分光光度法的基本原理和分光光度計的使用方法】定義:分光光度法是利用物質所特有的吸收光譜來鑒別物質或測定其含量的分析檢測技術。特點:靈敏、精確、快速和簡便，在復雜組分系統中，不需要分離，即能檢測出其中所含的極少量物質。應用:生物化學研究中廣泛使用的方法之一，廣泛用于糖，蛋白質，核酸，酶等的快速定量檢測。

現在是12頁\一共有20頁\編輯于星期四分光光度計的分類

紅外分光光度計:可見光分光光度計:紫外分光光度計:測定波長范圍為大于760nm的紅外光區

測定波長范圍為400~760nm的可見光區測定波長范圍為200～400nm的紫外光區現在是13頁\一共有20頁\編輯于星期四可見光譜可見光范圍內波長和顏色的關系現在是14頁\一共有20頁\編輯于星期四分光光度計的基本結構

無論哪一類分光光度計都包括：光源、單色器、吸收池、檢測器和測量儀表。分光光度計各部件的次序如圖所示:

入射光強度Io透射光強度I樣品池

檢測器及儀表單色器光源現在是15頁\一共有20頁\編輯于星期四光照射到物質上，物質的分子結構決定哪些特定波長的光被吸收。這一現象符合符合朗伯－比耳定律。入射光強度Io樣品濃度c光程b透射光強度I當一束平行單色光(I0)照射有色溶液時，光的一部分被吸收，一部分透過溶液(I)現在是16頁\一共有20頁\編輯于星期四朗伯—比爾定律:

A=lg(1/T)=Kbc

A為吸光度;T為透光度,是透射光強度比上入射光強度（I/I0);c為吸光物質的濃度;b為吸收層厚度(光程）.

物理意義當一束平行單色光垂直通過某一吸光物質時,其吸光度A與吸光物質的