酶促反應動力學第10章一、有關的化學動力學概念（自學，化學學習的內容）

二、底物濃度對酶促反應速率的影響

三、多底物的酶促反應

四、影響酶促反應速率的其他因素

五、酶的抑制作用

教學內容酶促反應動力學：研究酶促反應的速度及其影響因素的科學。為酶的機理研究提供實驗證據，指導酶在生產中的應用。(一)酶促反應動力學的基本公式-米-曼氏方程

(二)米-曼氏方程所確定的圖形是一直角雙曲線

(三)米-曼氏動力學參數的意義

(四)米-曼氏方程的線性化作圖求Km和Vmαx值二、底物濃度對酶促反應速率的影響酶濃度、pH、溫度等條件不變情況下,研究底物濃度和反應速度的關系。低底物濃度時,反應速度與底物濃度成正比，一級反應。底物濃度達到一定值后，幾乎所有的酶都與底物結合，反應速度達到最大值(Vmax)，此時再增加底物濃度，反應速度不再增加，零級反應。教學內容混合級反應一級反應零級反應(飽和效應)非催化反應1913，德化學家MichaelisL和MentenM根據中間產物學快速平衡模型或平衡穩態模型，稱為米-曼氏模型。中間復合體學說：Ks：解離[平衡]常數；Kcat：催化常數(一)酶促反應動力學的基本公式：米-曼氏方程k-1游離的酶與底物形成ES的速度極快，而ES形成產物的速度極慢，ES分解成產物P對于[ES]濃度的動態平衡沒有影響。ES的生成速度：K1([Et]-[ES])[S]ES的分解速度：K-1[ES]K1([Et]-[ES])[S]=K-1[ES]

V

max

=Kcat[Et]此模型不具有普遍性steady-statetheory：反應進行不長的一段時間內(幾毫秒，前穩態)，系統的ES濃度由0增加到一定數值，在一定時間內，盡管底物濃度不斷變化，ES也在不斷合成和分解，但是當反應系統中ES的生成和分解速率相等時，絡合物ES的濃度保持不變，這種狀態稱為穩態1952，BriggsGE和HaldaneJBS的“穩態理論”及其對米式方程的發展：穩態模型或Briggs-Haldane氏模型K-1

K-2酶促反應過程中前穩態和穩態期間各種濃度變化（A）和速率變化（B）ES生成速度：K1([Et]-[ES])[S]ES分解速度：k2[ES]+k-1[ES]穩態時：k1([Et]-[ES])[S]=k2[ES]+k-1[ES]Vmax=kcat[Et]K-1

K-2Km比Ks更具普遍性。穩態下，當K2<<K-1時，則Km=K-1/K1=Ks，因此平衡態可以看成是穩態的一個特例從米-曼氏方程或其曲線可以看出三種情況：(三)米一曼氏動力學參數的意義KM的意義:真實解離常數和表觀解離常數Kcat

的意義:催化常數或轉換數Kact/KM

的意義:催化效率指數或專一性常數米氏常數KM是v0=1/2Vmax時的底物濃度。遵循米-曼氏動力學的酶,也稱為米-曼型酶,是指呈現v0對[S]的雙曲線關系的酶。KM的真實意義決定于酶促反應機制的特定方面,如反應步驟數目和各步的速率常數。對于簡單的二步反應：

KM=(K-1+K2)/K1

1.KM的意義:真實解離常數和表觀解離常數當K2是限速步驟的速率常數時，即k2<<k-1，KM即Ks。此時，KM

的意義是真實解離常數，代表ES復合體中酶對底物的親和力大小，但是這種意義對大多數酶是不適用的。當k2、k-1相當時，KM是三個速率常數的函數。P1為了某些用途,KM可以作為表觀解離常數來處理。例如溶液中游離酶的濃度[E]可以從下列關系式算得:[ES]所有形式的結合酶濃度的總和,如上式為[ES]+[EP]按式上式模型可以證明：因此KM可看成是所有結合酶的整體解離常數，這就是KM作為表觀解離常數的意義。以胰凝乳蛋白酶催化酯和酰胺類水解為例：特征常數：一般只與酶的性質有關，與酶的濃度無關。KM值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的KM值。判斷酶的專一性和天然底物：KM最小的底物為最適或天然底物。判斷酶與底物結合的難易：KM是ES分解速度(K-1+K2)與形成速度(K1)的比值，包含ES解離趨勢(K-1／K1)和產物形成趨勢(K2／K1)。Ks稱為底物常數，Ks=K-1／K1，是ES的解離常數，反映ES解離趨勢，1/Ks：酶與底物親和力大小(ES形成趨勢)，底物親和力大不一定反應速度大(產物形成趨勢，K2／K1)，只有當K-1、K1>>K2時，KM≈Ks，1/Km近似地表示底物親和力的大小。生產上的實際應用：已知V求[S];已知[S]求V判斷某一代謝反應的方向和途徑Km的應用2.Kcat的意義：催化常數或轉換數K-1

K-2K-1K2限速步驟速率常數K3限速步驟限速常數需要提出一個更通用的速率常數，催化常數，Kcat，用來描述任一酶促反應在飽和時的限制速率如果一個多步驟的反應,其中一步明顯是限速的,則該步驟的速率常數就是Kcat，K2和K3。如果幾個步驟都是部分限速的,Kcat可以是幾個速率常數的一個復雜函數,例如Kcat是k2、k3的函數當[E]和[S]均為變量時，Kcat

是E+S→E+P反應的表觀二級速率常數(單位mol-1·s-1·L)；Kcat/KM可作為在遠低于飽和量的底物濃度下酶的催化效率指數。此參數常用來比較不同酶的催化效率，特別是比較同一個酶對不同底物(競爭性底物)的催化效率，因此也稱為專一性常數。當酶與底物的相互碰撞是限速步驟時，Kcat/KM可代表真實的微觀速率常數。當K2>>K-1時，KM=k2/k1,而kcat=k2，3.Kact/km的意義:催化效率指數或專一性常數則：根據：在生理條件下，大多數酶并不被底物所飽和。當[S]<<Km時，大多數酶處于游離形式[E]≈[Et]:因此:k1存在一個上限，取決于酶與底物在水溶液中的碰撞頻率。如果每次碰撞都能形成ES復合體，則根據擴散理論預言，k1將約為108－109mol-1·s-1·L，這是擴散控制的極限范圍。酶的催化效率不能超過此極限范圍。直接按米-曼氏方程作圖，通過漸近線求出Vmax，再從Vmax/2求出相應的[S]，即KM。不準確，只能得到Vmax和KM的近似值，即使[S]足夠大，v0也很難達到漸近線水平(Vmax)。(四)米一曼氏方程的線性化作圖求KM和Vmax值一、有關的化學動力學概念（自學）

二、底物濃度對酶促反應速率的影響

三、多底物的酶促反應

四、影響酶促反應速率的其他因素

五、酶的抑制作用

教學內容三、多底物的酶促反應酶促反應多是兩個以上的底物參加的反應，其中雙底物的反應最為重要，占50%；連接酶，三底物，占6%。

只有當[A]、[B]都達到使酶飽和時，測得的Vmax才是雙底物反應的真正最大速率固定[B]、改變[A]固定[A]、改變[B]BK[B]VAK[A]VQPBABMBmax0AMAmax0+=+=+???+vv酶雙底物酶促反應有三種機理：2.乒乓反應或雙置換反應隨機順序反應機理；有序順序反應機理(依次反應)；1.序列或單置換反應谷丙轉氨酶2.乒乓反應或雙置換反應一、有關的化學動力學概念（自學）

二、底物濃度對酶促反應速率的影響

三、多底物的酶促反應

四、影響酶促反應速率的其他因素

五、酶的抑制作用

教學內容植物和微生物來源的酶：pH4.5～6.5；動物來源的酶：pH6.5～8.0之間。例外情況，胃蛋白酶pH1.9，胰蛋白酶pH8.1，肝精氨酸酶pH9.0；酶的最適pH只在一定條件下才有意義。酶的最適pH一般在4.0～8.0之間：溫度系數Q10：溫度升高10℃，反應速度與原來的反應速度（或是速率常數與原速率常數）之比，Q10一般為1~2。最適溫度范圍：溫血動物的酶，35℃-40℃；植物酶40℃-50℃；細菌TaqDNA聚合酶，70℃。（二）溫度對酶反應速度的影響溫度對酶促反應速度的影響有兩個方面：提高溫度，加快反應速度（0～40℃）；提高溫度，酶變性失活(>60℃)。（三）激活劑對酶反應速度的影響激活劑（activator)：凡是能提高酶活性的物質。陰離子：Cl-、Br-、I-、PO4-氫離子無機離子還原劑：如，還原型谷胱甘肽等能激活某些活性中心含有-SH的酶。小分子有機化合物激活劑種類金屬離子：K+

、Na+、Mg2+

、Zn2+、Fe2+

、Ca2+

金屬螯合劑：如，EDTA等，去重金屬離子，解除抑制作無機離子的激活作用具有選擇性；不同離子之間有拮抗作用，如Na+與K+、Mg2+與Ca2+，但Mg2+與Zn2+常可替代；激活劑濃度要適中，1~50mM，過高往往有抑制作用；許多金屬離子是酶的輔助因子，有些金屬離子可穩定酶分子的活性構象，有的金屬離子通過生成螯合物，在酶與底物結合中起橋梁作用。要說明的幾個問題：使一些本來有活性的酶活性進一步提高，主要是離子或簡單有機化合物；激活酶原，無活性→有活性，可能是離子或蛋白質。激活劑作用包括兩種情況：一、有關的化學動力學概念（自學）

二、底物濃度對酶促反應速率的影響

三、多底物的酶促反應

四、影響酶促反應速率的其他因素

五、酶的抑制作用

教學內容五、酶的抑制作用(一)抑制作用的概念(二)抑制作用的類型(三)可逆抑制的動力學(四)酶抑制劑應用舉例抑制劑：不引起酶蛋白變性，和酶分子上某些必需基團（活性中心上一些基團）結合，引起酶活性下降，甚至喪失。抑制劑有選擇性。抑制作用：使反應速率減慢或完全停止（不可逆抑制、可逆抑制）變性劑：使酶蛋白變性而引起酶活力降低或喪失。無選擇性，涉及整個三級結構。抑制程度表示方法：相對活力(a)；抑制分數(i)(一)抑制作用的概念研究抑制劑對酶的作用的意義：藥物作用機理和抑制劑型藥物的設計與開發：抗癌藥；闡述某些代謝途徑，控制發酵；研究酶的催化機制，是酶工程和化學修飾酶、酶工業的基礎。不可逆抑制作用可逆抑制作用（二）抑制作用的類型抑制劑與酶的結合是非共價的、可逆的，可以用透析或超過濾等方法除去抑制劑，使酶活性恢復。抑制劑I與游離酶E和ES之間存在平衡關系，抑制程度由酶對抑制劑的親和力、抑制劑濃度和底物濃度三者所決定的。這類抑制可用米-曼氏動力學方程進行分析。1.可逆抑制(reversibleinhlbition)抑制劑(大多數毒物)和酶的結合是共價的，不能用一般的物理方法解除抑制而使酶“復活”，必須通過特殊的化學處理才可能將抑制劑從酶分子上移去。這類抑制不能米-曼氏動力學方程進行分析2.不可逆抑制(irreversibleinhilItlon)1.可逆抑制(reversibleinhlbition)：競爭性抑制：反競爭性抑制：非競爭性抑制：I和S結構相似，競爭酶的活性部位，如，丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制。競爭性抑制可以借助增加底物濃度而解除。競爭性抑制：I只能和ES結合，形成IES三元復合體。I不影響酶與底物的結合，但它阻止IES生成產物。I傾向于使ES復合體更加穩定。反競爭性抑制：I與酶活性部位以外的地方結合，既能與游離酶E結合，也能與ES結合，并且底物和抑制劑與酶的結合嚴格地互不干擾，有人稱之為純非競爭性抑制。純非競爭性抑制較少遇到，多數情況是E與I的結合和E與S的結合互有影響,被稱為混合型非競爭性抑制或混合型抑制。非競爭性抑制：

(三)可逆抑制作用動力學1.競爭性抑制動力學特點：表觀Vmax，表觀KM2.非競爭性抑制動力學特點：表觀Vmax，表觀KM3.反競爭性抑制動力學特點：表觀Vmax，表觀KM(四)酶抑制