化學修飾的原理化學修飾的方法學蛋白質側鏈的修飾蛋白質肽鏈的交聯親和標記蛋白質化學修飾的應用內容提要（第九講）三、羧基的修飾用水溶性碳二亞胺作催化劑，通過胺專一地修飾蛋白質中的羧基。++HX+碳二亞胺形成相應酰胺重排四、巰基的修飾由于半胱氨酸時蛋白質中反應性最強的殘基，所以很多試劑可用來修飾巰基側鏈。常用的有三類：1.碘乙酸、碘乙酰胺或環乙烯亞胺2.馬來酰亞胺或馬來酸酐3.有機汞試劑（一）1類試劑是烷化劑，此類試劑還能與甲硫氨酸、賴氨酸或組氨酸反應。pH﹥7碘乙酸半胱氨酸副反應：pH﹥5.5組氨酸+對氯汞苯甲酸+S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸（四）5，5′-二硫雙硝基苯甲酸（DTNB）也常用于修飾巰基，它與半胱氨酸形成混合二硫化物。+pH﹥6.5+DTNB2-硝基-5-硫代苯甲酸釋放出的2-硝基-5-硫代苯甲酸陰離子在412nm處有吸收，可用光譜法測定其含量。五、組氨酸咪唑基的修飾常用試劑是焦碳酸二乙酯和碘乙酸。1-羧乙基組氨酸3-羧乙基組氨酸1，3-二羧乙基組氨酸+pH4～7+焦碳酸二乙酯碘乙酸用碘乙酸烷化組氨酸殘基可得單取代或雙取代衍生物。焦碳酸二乙酯能使咪唑環上的一個氮原子羧乙基化.羥胺可使反應可逆進行，回收組氨酸。+pH=7+羥胺六、色氨酸吲哚基的修飾（一）N-溴琥珀酰亞胺（NBS）常用來修飾色氨酸。它氧化吲哚基成為羥吲哚衍生物。酪氨酸也能與NBS作用。（二）各種芐基鹵化物能使吲哚環烷基化最常用的是2-羥基-5-硝基芐基溴，由于溶解度的問題，常用它的類似物二甲基（2-羥基-5-硝基芐基）锍鹽。應注意的問題該試劑在水介質、高pH下不穩定，迅速水解為CO2和乙醇。試劑大大過量時可與咪唑環上的兩個氮都作用，形成雙取代衍生物。羥胺不能使雙取代物發生可逆反應，而是清除咪唑環。八、甲硫氨酸甲硫基的修飾用H2O2和過甲酸可將甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亞砜，用碘乙酸烷化甲硫氨酸殘基，能形成正甲硫鹽。九、絲氨酸羥基的修飾甲苯磺酰氟（PMSF)可與絲氨酸殘基作用。++四硝基甲烷3-硝基酪氨酸試劑修飾的側鏈LysGluCysArgSerHisTyrTrpMet醋酸酐××××酰基酸酐×××醛××××N-溴琥珀酰亞胺××××碳二亞胺×苯異硫氰××四硝基甲烷×三硝基苯磺酸×焦碳酸二乙酯××碘乙酸××××環乙烯亞胺××××甲苯磺酰氟×馬來酰胺××常用重要修飾劑的專一性第四節蛋白質肽鏈的交聯雙功能試劑：具有兩個反應活性部位，可以在相隔較近的兩個氨基酸殘基間搭橋、形成多肽鏈內、多肽鏈間或者蛋白質分子之間的交聯，而不引起蛋白質構象的重大改變的試劑。一、設計或選擇交聯劑要考慮的因素（一）反應的專一性交聯劑分為同型雙功能試劑異型雙功能試劑（二）交聯距離隨著交聯劑兩個功能基之間距離跨度的增加，形成交聯的可能性也隨之增加。（三）可裂解性研制可裂解交聯劑有助于分離和表征交聯片斷。光活化雙功能試劑能與胺反應的基團能與巰基反應的基團（一）同型雙功能試劑交聯劑兩端具有相同的反應活性部分。雙亞氨酯，可與氨基反應。兩端間的間隔基團是（CH2）n若間隔基團含有二硫橋，則成為可裂解同型雙功能試劑。所有同型雙功能試劑都對氨基有專一性，但戊二醛例外，它除了與氨基反應外，還可與羥基反應。雙亞氨酸酯（非裂解）二甲基-3，3′-二硫代-雙丙基亞氨酯（可裂解）（二）異型雙功能試劑這類試劑的一端與氨基作用，另一端與巰基側鏈作用，但用碳二亞胺時，另一端反應基團是羧基。這類交聯劑的一端含有氨基反應部分，N-羥琥珀酰亞胺，另一端含有巰基反應部分，馬來酰亞胺或聯硫基。2N-羥琥珀酰亞胺辛二酸酯（非裂解）N-琥珀酰胺-3-（2-吡啶二硫代)丙酸酯（三）可被光活化的試劑這類試劑是異型雙功能試劑的擴展。當交聯劑一端的反應基團與蛋白質作用之后，經光照另一端則產生一個反應活性部分，這部分即可是碳烯，也可是氮烯。這類交聯劑一端一般含有能與氨基或巰基反應的基團，而另一端則含有對光敏感的基團。三、交聯劑的使用蛋白質與交聯劑的反應直接有助于蛋白質構象的穩定性交聯劑可用來測定蛋白質亞基的量能形成分子間的交聯鍵，使蛋白質對變性穩定。兩種酶通過交聯形成雜化酶。交聯可提高酶分子構象的穩定性。可測定齊聚體蛋白質的分子量和亞基數目。測定蛋白質上殘基間的距離。測定酶的活性部位。一、內生親和試劑IO4-+ENZ-(CH2)4-NH2NaBH4O-ATP與氨基反應過碘酸氧化的ATP（O-ATP）與氨基側鏈的可能反應希夫堿化合物+ENZ-(CH2)4-NH2+ENZ-CH2SHO-ATPO-ATP與巰基反應與氨基反應過碘酸氧化的ATP（O-ATP）與賴氨酸側鏈的可能反應過碘酸氧化的ATP（O-ATP）與巰基側鏈的可能反應嗎啉型加合物缺點：產生的二醛幾乎全部與賴氨酸側鏈反應，不能與更多類型側鏈反應。嘌呤核苷酸的烷基鹵化衍生物也可看作是親和試劑，各種親和側鏈如Cys、His、Lys、Met等能與試劑上的鹵原子反應。ATP腺苷-5′-氯代甲烷焦磷酸酯腺苷-5′-(β-磷酸氯乙酯）Aden-為腺苷ATP的烷基鹵化衍生物由于這兩種試劑的結構與ATP相似，才看作是內生親和試劑。（三）光親和試劑是一類特殊的外生親和試劑。優點：光活化產生的自由基（碳烯或氮烯）能無選擇地與各類側鏈反應。8-疊氮腺苷三磷酸芳基疊氮-β-丙氨酸NAD試劑中的光親和基團是通過核糖的羥基連接的。疊氮衍生物可看作是內生親和試劑，而芳基疊氮衍生物是外生親和試劑。第六節蛋白質氨基酸的敏化光氧化蛋白質的敏化光氧化：當敏化劑與蛋白質共存時，若用可見光照射，則敏化劑產生化學變化，使蛋白質側鏈氧化。敏化光氧化需分子氧，而啟動光氧化反應的是處于激發三重態的敏化劑。敏化光氧化的反應機理，有兩種解釋：1.敏化光氧化并不決定于敏化劑與蛋白質之間的結合。2.蛋白質先與三重態的敏化劑發生專一性的結合反應，產生自由基離子，再與分子氧反應，形成蛋白質氧化產物。影響光敏化反應效率和選擇性的主要因素是敏化劑對蛋白質的結合作用。使用能與蛋白質共價結合的敏化劑，可以了解某些氨基酸殘基在蛋白質空間構象中配置情況，也可測定蛋白質中包埋的和暴露的基團。第七節蛋白質化學修飾的應用一、用來測定蛋白質分子中某種氨基酸的數量常用方法:對氯苯甲酸與巰基作用；三硝基苯磺酸與氨基作用;熒光胺與氨基作用等。二、在蛋白質序列分析中的應用（一）控制酶解程度用三氟乙酰法將Lys的ε-NH2保護起來變成酶不能水解的產物。通過化學修飾將Cys轉變成S-氨乙酰-Cys通過化學修飾將Ser轉變成S-氨乙酰-Cys例如用胰蛋白酶只水解精氨酸形成的肽鍵。如果要增加胰蛋白酶水解位置。（二）化學裂解用化學方法裂解肽鍵是常用方法。普遍采用的是用溴化氰專一裂解M