第十四章RNA的生物合成Transcription1學(xué)習(xí)目的及基本要求（1）掌握轉(zhuǎn)錄的概念及轉(zhuǎn)錄的基本過程。（2）熟悉RNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾過程。2教學(xué)內(nèi)容（1）轉(zhuǎn)錄的概念、不對稱轉(zhuǎn)錄的含義；編碼鏈和非編碼鏈的意義；原核生物RNA聚合酶的組成及作用；真核生物RNA聚合酶的分類及作用。（2）啟動子的定義及-35區(qū)與-10區(qū)的堿基組成特點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄泡結(jié)構(gòu)特征。（3）轉(zhuǎn)錄的基本過程；原核生物轉(zhuǎn)錄終止的方式及ρ因子的作用。（4）三種RNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾；核酶的概念及結(jié)構(gòu)特征。3概述基因表達(dá)(geneexpression)轉(zhuǎn)錄(transcription)轉(zhuǎn)譯(translation)四類RNA：rRNA、mRNA、tRNA、smallRNA(snRNA、miRNA)及RNAworld5第一節(jié)DNA指導(dǎo)RNA的合成轉(zhuǎn)錄(transcription)：以DNA為模板，四種三磷酸核苷為原料，按照堿基配對原則，在RNA聚合酶催化下合成RNA的過程。即把DNA的堿基序列轉(zhuǎn)抄為互補(bǔ)的RNA堿基排列順序。6轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)1、轉(zhuǎn)錄方式為不對稱轉(zhuǎn)錄2、無需引物3、RNA聚合酶催化4、底物為NTP5、方向?yàn)?’→3’7一、RNA聚合酶

Weiss的鼠肝抽提物RNA聚合酶(DNAdependentRNApolymerase,DDRP,RNA-pol)原核一種、真核三種RNA聚合酶NTP+(NMP)n(NMP)n+1+PPiRNA-pol,Mg2+9（一）原核生物的RNA聚合酶大腸桿菌(E.coli)RNA聚合酶：4種亞基、、’、組成的五聚體蛋白質(zhì)，分子量465kD。亞基分子量功能

36512決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄150618與轉(zhuǎn)錄全過程有關(guān)（催化）’155613結(jié)合DNA模板（開鏈）70263辨認(rèn)起始點(diǎn)9000未知101）全酶(holoenzyme)：2’

，即亞基+核心酶，亞基的功能是辨認(rèn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄起始階段需要全酶2）核心酶(coreenzyme)：2’能催化NTP按模板的指引合成RNA，在轉(zhuǎn)錄延長全過程中均起作用3）利福平(rifampicin)或利福霉素的作用4）合成速度和校正功能11原核生物的RNA聚合酶全酶及其在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合，DNA雙鏈已打開，σ因子尚未脫落13（二）真核生物的RNA聚合酶真核生物的基因組遠(yuǎn)比原核生物龐大，其RNA聚合酶也更為復(fù)雜。真核生物的RNA聚合酶I、II、III都由多個(gè)亞基組成，可用電泳法將各亞基分離。真核生物RNA聚合酶中沒有細(xì)菌RNApol中s因子的對應(yīng)物，因此必須借助各種轉(zhuǎn)錄因子才能識別或選擇啟動部位，并結(jié)合到啟動子上。14酶的種類功能對a-鵝膏蕈堿敏感性RNA聚合酶I合成45S-rRNA前體，經(jīng)加工產(chǎn)生5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA不敏感RNA聚合酶II合成所有mRNA前體(hnRNA)和大多數(shù)核內(nèi)小RNA(snRNA)敏感RNA聚合酶III合成小RNA，包括tRNA、5SrRNA、U6snRNA和scRNA中等敏感RNA聚合酶Mt合成線粒體內(nèi)的RNAs不敏感，但對利福平敏感15二、轉(zhuǎn)錄的模板不對稱轉(zhuǎn)錄定義：就某一確定活化基因的轉(zhuǎn)錄，只能以DNA雙鏈的一條鏈作為模板，這種現(xiàn)象稱為不對稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)。兩重含義：(1)雙鏈DNA只有一股單鏈用作模板參與轉(zhuǎn)錄。(2)模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一單鏈上。17DNA雙鏈在轉(zhuǎn)錄過程中只有一條鏈中的其中某一活化基因片段起作用，該鏈稱模板鏈(templatestrand)，又稱負(fù)(-)鏈；與其互補(bǔ)的鏈稱為編碼鏈(codingstrand)，又稱正(+)鏈。一般書寫都為編碼鏈。轉(zhuǎn)錄生成的RNA鏈與編碼鏈的堿基序列相似，以U取代T。體外轉(zhuǎn)錄時(shí)會失控。18不對稱轉(zhuǎn)錄19轉(zhuǎn)譯21222.真核生物的啟動子由轉(zhuǎn)錄因子而不是RNA聚合酶所識別，形成前起始復(fù)合物(PIC)真核：較長，識別部位：CAAT盒、GC盒；結(jié)合部位：TATA盒；起始部位順式作用元件(cis-actingelement)轉(zhuǎn)錄因子：通用因子、上游因子和可誘導(dǎo)因子。23（二）終止子(terminator)提供轉(zhuǎn)錄停止信號的DNA序列。原核生物存在兩類終止子1)不依賴于Rho()的終止子2)依賴于Rho()的終止子1.終止序列特征2.Rho因子()通讀(readthrough)和抗終止因子251）不依賴于rho()的終止子RNA產(chǎn)物3’端往往形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)阻礙RNA聚合酶前移。莖環(huán)結(jié)構(gòu)后有一串寡聚U。寡聚U有利于RNA不再依附DNA模板鏈而脫出。26⑤Rho因子作用機(jī)制：Rho因子結(jié)合在新生的RNA鏈上，結(jié)合后Rho因子和RNA聚合酶都發(fā)生構(gòu)象變化，從而使RNA聚合酶停頓，Rho因子解螺旋酶活性使DNA/RNA雜化雙鏈拆離，利于產(chǎn)物從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中釋放。29底物四種三磷酸核苷NTP既為RNA的合成提供核苷酸原料，又為合成反應(yīng)提供能量。30第二節(jié)轉(zhuǎn)錄過程大腸桿菌轉(zhuǎn)錄過程包括模板的識別、轉(zhuǎn)錄起始、延伸、終止三步。真核生物的轉(zhuǎn)錄，除延長過程相似外，起始、終止都與原核生物有較多的不同。31一、原核生物的轉(zhuǎn)錄過程20世紀(jì)60年代初，Jacob和Monod發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌基因表達(dá)的主要形式----操縱子(operon)，即一個(gè)啟動子控制連在一起的多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。32

（一）轉(zhuǎn)錄的起始階段特點(diǎn)：（1）不需引物；（2）RNA-pol催化；（3）生成磷酸二酯鍵；（4）轉(zhuǎn)錄生成的第一個(gè)核苷酸總是GTP或ATP,以GTP更為常見。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物：

RNA-pol全酶、DNA模板和四磷酸二核苷酸(pppGpN-OH3’)三者結(jié)合在一起的復(fù)合體。3334（二）轉(zhuǎn)錄的延長階段轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物形成后，亞基即脫落，使核心酶構(gòu)象發(fā)生改變，與DNA模板的結(jié)合變得松散，有利于RNA聚合酶沿DNA鏈的3’→5’方向迅速向前移行。每移行一步都與一分子三磷酸核苷生成一個(gè)新的磷酸二酯鍵，使合成的RNA鏈按照5’→3’方向不斷延伸。形成酶-DNA-RNA轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。35轉(zhuǎn)錄空泡(transcriptionbubble)：也稱轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，是由RNA-pol核心酶、DNA模板和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA三者結(jié)合在一起的復(fù)合體。36（三）轉(zhuǎn)錄的終止1、原核生物的轉(zhuǎn)錄終止大腸桿菌E.coli存在兩類終止子(1)非依賴rho()的終止子(2)依賴rho()的終止子終止因子：協(xié)助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子為蛋白質(zhì)。373839二、真核生物的轉(zhuǎn)錄過程真核生物的轉(zhuǎn)錄過程與原核生物的轉(zhuǎn)錄過程的主要區(qū)別。1）RNA聚合酶和產(chǎn)物2）RNA聚合酶不直接結(jié)合模板3）轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化4）轉(zhuǎn)錄終止與轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)40（一）轉(zhuǎn)錄的起始典型的真核生物基因上游序列示意圖41反式作用因子反式作用因子(trans-actingfactor)：能直接或間接辨認(rèn)、結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)。因子之間又需相互辨認(rèn)、結(jié)合以準(zhǔn)確控制基因是否轉(zhuǎn)錄。反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionalfactor,TF)：TFI、II、III42真核生物RNA聚合酶不與DNA分子直接結(jié)合。在眾多TFII中TFIID(TFIIDz)是目前已知唯一能結(jié)合TATA盒的蛋白質(zhì)。TF有多個(gè)結(jié)構(gòu)域(domain)：結(jié)合DNA、結(jié)合其他TF，激活其他TF，激活其他酶。43形成PIC的順序如下

PICRNA-polII/TFIIFTFIIE、HTFIIBTFIIATFIIDTATA拼板理論。44PIC的形成原核生物的因子和真核生物的眾多TFII在進(jìn)化上有親緣關(guān)系。45（二）轉(zhuǎn)錄的延長真核生物的轉(zhuǎn)錄延長與原核生物相似。核小體移位和解聚現(xiàn)象。46（三）轉(zhuǎn)錄的終止真核生物的轉(zhuǎn)錄終止是和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)的。模板鏈讀碼框架的3’端之后常有一組共有序列AATAAA，其下游還有較多GT序列，這些稱為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)。474849第三節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄后加工mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工RNA加工修飾的主要類型：剪切、剪接、添加核苷酸、化學(xué)修飾、RNA編輯等50一、原核生物中RNA的加工rRNA基因與某些tRNA的基因組成混合操縱子。其余tRNA基因也成簇存在，并與編碼蛋白質(zhì)的基因組成操縱子。它們在形成多順反子轉(zhuǎn)錄物后，經(jīng)斷裂成為rRNA和tRNA的前體，進(jìn)一步加工成熟。51（一）原核生物rRNA前體的加工大腸桿菌共有7個(gè)rRNA的轉(zhuǎn)錄單位每個(gè)單位由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA以及一個(gè)或幾個(gè)tRNA的基因所組成?；蛟蹀D(zhuǎn)錄物的沉降系數(shù)為30S，分子質(zhì)量為2.1×103kD，約6500個(gè)核苷酸。含有多個(gè)甲基化修飾成分，包括甲基化堿基和甲基化核糖，尤其常見為2’-甲基核糖。5253（二）原核生物tRNA前體的加工大腸桿菌染色體基因組共有tRNA的基因約60個(gè)，大多成簇存在。tRNA前體的加工包括：1)核酸內(nèi)切酶在tRNA兩端切斷；2)核酸外切酶從3’端逐個(gè)切去附加順序，進(jìn)行修剪；2)在tRNA3’端加上CCAOH；4)核苷酸的修飾和異構(gòu)化。成熟的tRNA中存在眾多的修飾成分。5455（三）原核生物mRNA前體的加工細(xì)菌中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的mRNA大多不需加工，一經(jīng)轉(zhuǎn)錄即可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)譯。也有少數(shù)多順反子mRNA需通過核酸內(nèi)切酶切成較小單位，再進(jìn)行轉(zhuǎn)譯。常形成操縱子。56二、真核生物中RNA的加工真核生物rRNA和tRNA前體的加工過程與原核生物有些類似真核生物mRNA前體必須經(jīng)過復(fù)雜的加工過程，這與原核生物大不相同。57（一）真核生物rRNA前體的加工真核細(xì)胞的rRNA基因(rDNA)屬于豐富基因單位的重復(fù)，成簇出現(xiàn)，稱為高度重復(fù)序列(highlyrepeatsequence)DNA。rDNA位于核仁之內(nèi)，自成一組轉(zhuǎn)錄單位。真核生物中45S的轉(zhuǎn)錄單位是三種rRNA的前身，經(jīng)剪接后，先后得到18S-rRNA,5.8S-rRNA及28S-rRNA。5859rRNA轉(zhuǎn)錄后加工60核酶（一）核酶的發(fā)現(xiàn)及其功用1、核酶(Ribozyme)：具有催化功能（酶的作用）的RNA分子。2、發(fā)現(xiàn)：八十年代初，Cech和Altman等，四膜蟲的rRNA和RNaseP中的M1RNA具有催化活性。（二）核酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)槌頭結(jié)構(gòu)(hammerheadstructure)，至少含有3個(gè)莖，1至3個(gè)環(huán)和至少有13個(gè)一致性的堿基位點(diǎn)。616263核酶的意義1、對中心法則的重要補(bǔ)充2、對傳統(tǒng)酶學(xué)的挑戰(zhàn)3、RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物作為催化劑：端粒酶、snRNP等4、代謝過程中核苷酸類為輔酶很常見：NAD+、FAD、CoA等5、人工合成的小片段RNA作為人工設(shè)計(jì)的核酶6465（二）真核生物tRNA前體的加工真核生物tRNA基因數(shù)目多，也成簇排列。成熟tRNA分子為4S，約70～80nt。tRNA前體的加工修飾包括：剪接，去掉5’末端及中部部分序列接尾，加3’-CCA稀有堿基形成，形成DHU，T，I，ψ等66（1）剪接67（2）連接-CCA尾成熟tRNA共有的特點(diǎn)。最末端腺苷酸的戊糖3’-OH或2’-OH是tRNA攜帶結(jié)合氨基酸位點(diǎn)，即該-OH與氨基酸的-COOH縮合相連。68（3）堿基修飾，形成稀有堿基1、甲基化：A→mAG→mG2、還原反應(yīng)：U→DHU3、核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)：U→4、脫氨反應(yīng)：A→I6970（三）真核生物mRNA前體的加工單個(gè)基因作為轉(zhuǎn)錄單位，不組成操縱子。多順反子和單順反子核不均一RNA(heterogeneousnuclearRNA,hnRNA)hnRNA轉(zhuǎn)變?yōu)閙RNA的加工過程：1)5’帽子結(jié)構(gòu)；2)3’多聚腺苷酸尾巴；3)內(nèi)含子剪接；4)核苷的甲基化；5)RNA編輯。711、5’-端加帽mRNA的帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppN)是在5’-端形成的。可能在轉(zhuǎn)錄的早期階段或轉(zhuǎn)錄終止前就已形成。727374帽子結(jié)構(gòu)的功能1、帽子結(jié)構(gòu)是前體mRNA在細(xì)胞核內(nèi)的穩(wěn)定因素，也是mRNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的穩(wěn)定因素，沒有帽子結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物很快被核酸酶水解。2、帽子結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)蛋白質(zhì)生物合成起始復(fù)合物的生成，因此提高了轉(zhuǎn)譯強(qiáng)度。752、3’末端加尾真核生物的成熟的mRNA3’-端通常都有100~200個(gè)腺苷酸殘基，構(gòu)成多聚腺苷酸(polyA)尾巴。polyA的出現(xiàn)不依賴DNA模板。加尾過程是在核內(nèi)進(jìn)行的。加工過程先由核酸外切酶切去3’-末端一些過剩的核苷酸，然后由多聚腺苷酸酶催化，以ATP為底物，在mRNA3’-末端逐個(gè)加入腺苷酸，形成poly尾。3’-末端切除信號是3’-端一段保守序列AAUAAA。7677polyA尾巴的功能1、mRNA由細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)所必需的形式2、大大提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性783、mRNA的剪接（1）斷裂基因(splitegene)：大多數(shù)真核基因都是斷裂基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)相互隔開但又連續(xù)鑲嵌而成。也有少數(shù)編碼蛋白質(zhì)的基因以及一些tRNA和rRNA基因是連續(xù)的。79外顯子(exon)在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列。內(nèi)含子(intron)隔斷基因的線形表達(dá)而在剪接過程中被除去的核酸序列。第一個(gè)被詳細(xì)研究的斷裂基因是雞的卵清蛋白基因，其全長為7.7kb。8081828384（2）核內(nèi)小RNA核內(nèi)小RNA(smallnuclearRNA,snRNA)大小在100～300nt之間?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的有U1、U2、U4、U5、U6等系列，因其中尿嘧啶含量較高而得名。每一snRNA與核內(nèi)數(shù)個(gè)和十多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合，組成snRNA-核蛋白體，稱為snRNP。U1、U2、U4、U5、U6snRNP參與hnRNA拼接。U3snRNP與rRNA前體的加工有關(guān)。85拼接體(spliceosome)為在被拼接RNA上由上述U系列snRNA和約50種蛋白質(zhì)所組成的復(fù)合物，沉降常數(shù)為50～60S，呈有突起的橢球體。拼接體是由U1、U2、U4、U5、U6snRNP以及一些拼接因子在RNA拼接位點(diǎn)逐步裝配而成。86878889

（3）hnRNA的拼接(splcing)剪接是把hnRNA中的內(nèi)含子除去，把外顯子連接起來。內(nèi)含子彎成套索狀，稱套索RNA(lariatRNA)，外顯子相互靠近并連接。3mG是形成套索必須的大多數(shù)內(nèi)含子都以GU為5’端的起始，而其末端為AG-OH-3’，5’GU……AG-OH-3’稱為剪接接口或邊界序列。剪接后，GU或AG不一定被剪除。90914、核苷的甲基化作用真核生物mRNA分子內(nèi)部往往有甲基化的堿基，主要是N6-甲基腺嘌呤(m6A)，這類修飾成分在hnRNA中已存在。也有一些真核細(xì)胞中無沒m6A。可能m6A對mRNA前體的加工起識別作用。925、RNA編輯(RNAediting)mRNA編輯是遺傳信息在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變，由一個(gè)基因產(chǎn)生不止一種蛋白質(zhì)。mRNA編輯作用說明，基因的編碼序列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后加工，是可有多用途分化的，因此，也稱為分化加工(differentialRNAprocessing)。93第四節(jié)RNA指導(dǎo)RNA的合成--RNA復(fù)制某些RNA病毒具有單鏈RNA基因組，感染宿主細(xì)胞后，它具有雙重功能1)具有mRNA活性，指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)合成；2)具有復(fù)制模板功能，指導(dǎo)自我復(fù)制。94RNA復(fù)制(RNAreplication)是以病毒RNA為模板合成RNA的過程，是RNA病毒繁殖的重要方式。需RNA復(fù)制酶(RDRP)。RNA復(fù)制缺乏即時(shí)校對作用，易出錯。RNA復(fù)制酶僅特異地對病毒RNA起作用，尚未發(fā)現(xiàn)引發(fā)宿主RNA復(fù)制的現(xiàn)象。95一、病毒含有正鏈RNA噬菌體Q和灰質(zhì)炎病毒