《生化實驗技術》綜合設計性大實驗合作性學習實驗實施流程及要求課堂理論學習：輔導相關生化大分子提取分離純化基本知識項目發布：了解項目內容網上預約：理論自學——設計實驗方案——網上遞交——教師修改及審核——實驗室項目實施——論文上交——教師批閱——評分實驗分組：各自組合，最多不超過4人/組，推選組長，負責平時討論、項目方案設計及材料收集實驗實施要求：平時按各組計劃時間分別進行實驗，組長有義務指導下組相關實驗內容，每次實驗必須登記。全班交流：實驗結束安排課堂討論交流，每組準備一人匯報，一人記錄；要求用PPT總結匯報項目實施、實驗創新、疑難點，其他組學生質疑，教師點評。指導教師：汪財生、斯越秀思考題（課前設疑）1.如何保持生化物質的生物活性？一般生化物質在堿性條件下容易變性，還是在酸性條件下容易變性？2.一般從天然生物材料制作生化物質的過程大體可分為幾個階段？3.在制備生化物質前應如何選擇原料？4.什么叫動態吸附和靜態吸附？它們在應用上有何區別？5.對酸性物質的提取，常在什么條件下進行？對堿性物質的提取，常在什么條件下進行？對兩性物質的提取，常在什么條件下進行？6.以血清球蛋白為例解釋提取制備每步驟的基本原理？7.干燥離子交換劑應如何進行處理？何謂離子交換劑轉型？8.動植物總DNA或RNA提取的方法主要有哪些？以豬脾臟DNA提取為例試述每步驟主要原理是什么？如何判斷所提取DNA的純度？9.蛋白質濃度測定方法有哪些？如何鑒定所提取蛋白的純度？未知蛋白質分子量測定方法有哪些？第一部分

生化物質的制備分析

一般從天然生物材料制作生化物質的過程大體可分為六個階段：

1.原料的選擇和預處理

2.原料的粉碎；3.提取，即從原料中經溶劑分離有效成分，制成粗品的工藝過程；4.純化，即粗制品經鹽析、有機溶劑沉淀、吸附、層析、透析、超離心、膜分離、結晶等步驟進行精制的工藝過程；

利用生化制備技術從生物材料中獲得特殊的生物活性物質，如蛋白質、酶、激素、核酸等生化產品時，通常要注意以下幾個問題：

6.成品及制劑，即半成品或原料藥經精細加工制成片劑、口服液、針劑、凍干劑等供飲用或臨床應用的各種劑型。5.干燥及保存；2．在生物材料中，有些化合物含量很低或極微，有的只有1／l0000，甚至更少。制備時，原材料用量很大，得到產品很少，與投料量相比“虎頭蛇尾”。近年來，用所謂“釣魚法”，利用某些分子特有的專一親和力，將某一化合物從極復雜的體系中“釣”出來，與其他化學分離技術相比具有很大的優越性。

3．許多生物活性物質，一旦離開了生物體內環境，很易變性及被破壞，應十分注意保護這些化合物生物的活性，常選擇十分溫和的條件，盡可能在較低溫度和潔凈環境中進行。一般來說制備的操作時間長、手續較繁瑣。因為許多大分子在分離過程中，過酸、過堿、重金屬離子、高溫、劇烈的機械作用、強烈的輻射和機體內自身酶的作用，均可破壞這些分子的結構或生理活性。

4．生化分離制備過程幾乎都在溶液中進行，各種溫度、pH、離子強度等參數，對溶液中各種組成的綜合影響，常常無法固定，有些實驗或工藝的設計理論性不強，常帶有很大的經驗成分。因此，要建立重復性好的成熟工藝，對生物材料、各種試劑及其輔助材料等都要嚴格地加以規定。

原料選擇和預處理

選什么樣的原材料應視生產目的而定。一般要注意以下幾個方面:

1．要選擇有效成分含量高的新鮮材料；2．來源豐富易得；3．制造工藝簡單易行；4．成本比較低；5．經濟效果要好。如蛋白質原料的選擇

蛋白質類生化產品的原料來源有動植物組織和微生物等，原則是要選擇富含所需蛋白質多肽成分的、易于獲得和易于提取的無害生物材料。

對天然蛋白質生化產品，為提高其質量、產量和降低生產成本，對原料的種屬、發育階段、生物狀態、來源、解剖部位、生物技術產品的宿主菌或細胞都有一定的要求，了解這些，可使分離純化工作事半功倍，反之則收效甚微。

2．發育生長階段

幼年動物的胸腺比較發達，老齡后逐漸萎縮，因此胸腺原料必須采自幼齡動物。

3．生物狀態

動物飽食后宰殺，胰臟中的胰島素含量增加，對提取胰島素有利，但膽囊收縮素的分泌使膽汁排空，對膽汁的收集不利。嚴重再生障礙性貧血癥患者尿中的EPO（erythropoietin,紅細胞生成素）含量增加。

4．原料來源

血管舒緩素可分別從豬胰臟和豬顎下腺中提取，兩者生物學功能并無二致，而穩定性以顎下腺來源為好，因其不含蛋白水解酶。6.從簡化提純步驟著手如從鴿肝中提取乙酰化酶，需將動物饑餓后取材，可減少肝糖原，以簡化純化步驟。7．對生物技術產品宿主菌或細胞的要求

選擇生物技術產品的宿主受體菌或細胞也應考慮到后處理的問題。如用大腸桿菌表達，由于其不能將所表達的蛋白質分泌到體外，故提取時必須破壁，增加了提取的困難，而且還可能含有毒素類有害因子；

不同的生物體或同一生物體不同的組織，其破碎的難易不一樣，使用的方法也不完全相同。動物的臟器組織，常用絞肉機機械法粉碎；植物肉質組織可以磨碎；許多微生物均具有堅韌的細胞壁，常用自溶、冷熱交替、加砂研磨、超聲波、加壓處理等破碎方法。如果提取的有效成分是體液或細菌胞外某些多肽激素、酶等，則不需要破碎細胞。

主要通過機械力的作用，使組織粉碎。粉碎少量原料時，可使用高速組織搗碎機（10000r／min）、勻漿器、研缽、研船等。工業生產上一般常用的粉碎設備有電磨機、球磨機、萬能粉碎機、絞肉機、擊碎機等。

(一)機械法

(二)物理法1.反復凍融法把待破碎的樣品冷至－15～－20℃，使之凝固，然后緩慢地溶解，如此反復操作，大部分動物性的細胞及細胞內的顆粒可以破碎。

在細菌或病毒中提取蛋白質和核酸時可用此法。操作時，將材料投入沸水中，在90℃左右維持數分鐘，立即置于冰浴中，使之迅速冷卻，絕大部分細胞被破壞。

2.冷熱交替法3．超聲波處理法

多用于微生物材料，處理的效果與樣品濃度、使用頻率有關。用大腸桿菌制備各種酶時，常用50～100mg／L菌體的濃度，在1KHz～10KHz（千赫茲）頻率下處理10～15min。對于其他細菌，則視具體情況而定。操作中注意避免溶液中氣泡的存在，制備對超聲波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。4.壓破碎法

加氣壓或水壓（如上海高壓勻漿泵廠生產的高壓勻質機），達20.59～34.32MPa（210～350kgf／cm2）的壓力時，可使90%以上細胞被壓碎。多用于微生物酶制劑的工業制備。

(三)生化及化學法

1．自溶法

即新鮮的生物材料存放在一定的pH和適當溫度下，利用組織細胞中自身的酶系將細胞破壞，使細胞內含物釋放出來的方法。自溶的溫度，動物材料選在0～4℃，微生物材料則多在室溫下進行。

自溶時，需加少量的防腐劑，如甲苯、氯仿等，以防止外界細菌的污染。因自溶的時間較長，不易控制，故制造具有活性的核酸、蛋白質時比較少用。2．酶處理法

用外來酶處理生物材料，如溶菌酶（Lysozyme）是專一地破壞細菌細胞壁的酶。如用噬菌體感染大腸桿菌細胞制造DNA時，采用pH8的0.1mol／L三羥甲基氨基甲烷（Tris）－0.01mol／L乙二胺四乙酸（EDTA）制成每毫升含2億個細胞的細胞懸液，然后加入100μg—1mg的溶菌酶，在37℃保溫10min，細菌胞壁即被破壞；還有把蝸牛酶用于酵母細胞的破碎；用胰酶處理豬腦制備腦安素。用于專一性分解細胞壁的酶還有纖維素酶（破壞植物細胞）、細菌蛋白酶、酯酶、殼糖酶等。3.表面活性劑處理法

表面活性劑的分子中，兼有親脂性和親水性基團，能降低水的界面張力，具有乳化、分散、增溶作用。較常用的有十二烷基硫酸鈉(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉等。

生化物質的提取

利用一種溶劑對不同物質溶解度的差異，從混合物中分離出一種或幾種組分的過程稱為提取（extraction），提取又稱萃取或抽提，其含義基本相同。用冷溶劑從固體態物質提取的過程可稱為浸漬（maceration）；用熱溶劑者可稱為浸提（digestion），也稱浸煮

一、物質的性質與提取（一）物質的性質與提取方法的選擇

選擇合適的溶劑系統與提取條件。

（二）活性物質的保護措施1．采用緩沖系統2．添加保護劑（半胱氨酸，還原性谷胱甘肽等）3．抑制水解酶的作用(SDS,EDTA)4．其他保護措施(避免過酸過堿和劇烈攪拌）（三）生化物質的提取

一般生產上多用2～3次提取。溶劑用量（L）為生物材料的2～5倍，少數情況也有用10～20倍量溶劑作一次性提取。目的是節省提取時間，降低有害酶的作用。

二、影響提取的因素

（－）溫度（二）酸堿度

（三）鹽濃度

三、提取方法

（一）用酸、堿、鹽水溶液提取（二）用表面活性劑提取（三）有機溶劑提取

對酸性物質的提取，常在堿性條件下進行；對堿性物質的提取，常在酸性條件下進行；對兩性物質的提取，則使水溶液的pH值在遠離該兩性物質的等電點為佳。（三）超臨界氣體的萃取技術

以氣體為萃取劑，當氣體處于超過臨界溫度和臨界壓力時，呈現一種既非液相又非氣相的流體，兼有液體和氣體的特性。如密度接近于液體，粘度卻接近于氣體，具有良好的溶劑性質。

氣體萃取劑必須具有臨界壓力低，臨界溫度接近于室溫，化學穩定性好，價廉易得等特點。主要有二氧化碳、氮氣、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷等，最常用的是二氧化碳。其方法主要有等溫法和等壓法兩種，借助于壓力或溫度的調節分離萃取劑與被萃取物。

該技術應用于酶、不飽和脂肪酸的提取（如魚油和卵磷脂的提取）、精制和回收，也可用于生化產品的溶劑脫除。某些生化產品在生產過程中，采用了丙酮和甲醇溶劑，欲脫去溶劑又要避免產品的分解，需選擇超臨界氣體提取。與減壓干燥法相比較，前者不多消耗能源，且縮短脫溶時間。

四、提取液的分離

提取所得到的溶液，需與固體或另一液體分離。溶液與固體的分離，一般處理方法有三種：自然沉降、過濾、離心。

自然沉降是在液體介質中，固體自然下沉而分離的過程。當混懸液處理量較大，且固體和液體的比重懸殊時，可用此法。沉降分層后，可用虹吸等方法將液體部分移去。

過濾系利用多孔材料阻留固體，而使液體通過，達到固體與液體分離的過程。離心是利用旋轉運動的離心力進行分離物料的一種操作，其中通過過濾介質分離液體和固體者為離心過濾；利用液體比重的大小分離出不同比重的液體者為離心分離；利用液固兩相比重的差異進行沉降分離者為離心沉降。生化物質的分離純化技術

生化物質分離純化技術包括：生化產品的分離分析和生化產品的制備。前者主要對生物體內各組份加以分離后進行定性、定量鑒定，它不一定要把某組分從混合物中分離提取出來；而后者則主要是為了獲得生物體內某一單純組分。

為了保護目的物的生理活性及結構上的完整性，生物產品的制備中的分離方法多采用溫和的“多階式”方法進行，即常說的“逐級分離”方法。為了純化一種生化物質常常要聯合幾個，甚至十幾個步驟，并不斷變換各種不同類型的分離方法，才能達到目的。因此操作的時間長，手續繁瑣，給制備工作帶來眾多影響。親和層析法具有從復雜生物組成中專一的“釣出”特異生化成分的特點，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗體和核酸等的純化中得到廣泛應用。（一）分離純化原理

（1）根據分子形狀和大小不同進行分離。如差速離心與超離心，膜分離（透析、電滲析）與超濾法，凝膠過濾法。

（2）根據分子電離性質（帶電性）的差異進行分離。如離子交換法，電泳法，等電聚焦法。

（3）根據分子極性大小及溶解度不同進行分離。如溶劑提取法，逆流分配法，分配層析法，鹽析法，等電點沉淀法及有機溶劑分級沉淀法。（4）根據物質吸附性質的不同進行分離。如選擇性吸附與吸附層析法。（5）根據配體特異性進行分離——親和層析法。（二）分離純化的程序和生產設計（1）確定制備物的研究目的及建立相應的分析鑒定方法；（2）制備物的理化性質穩定性的預備試驗；（3）材料處理及抽提方法的選擇；（4）分離純化方法的摸索；（5）產物的均一性測定。

1．分離純化初期使用方法的選擇

早期分離純化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法較為有利，這些方法負荷能力大，分離量多兼有分離提純和濃縮作用，為進一步分離純化創造良好的基礎。

早期分離方法的選擇原則是從低分辨能力到高分辨能力，而且負荷量較大者為合適，但隨著許多新技術的建立，一個特異性方法的分辨力愈高，便意味著提純步驟愈簡化，收率愈高，生化物質的變性危險愈少，因此親和層析法，纖維素離子交換層析法、連續流動電泳、連續流動等電聚焦等在一定條件下，也用于從粗提取液中分離制備小量目的物。2．各種分離純化方法的使用程序

生化物質的分離都是在液相中進行，故分離方法主要根據物質的分配系數，分子量大小，離子電荷性質及數量和外加環境條件的差別等因素為基礎。例如純化其一兩性物質時，前一步已利用該物質的陰離子性質，使用了陰離子交換層析法，下一步提純時再應用其陽離子性質作層析或電泳分離便會取得較好分離效果。

如有些雜質在各種條件下帶電荷性質可能與目的物相似，其分子形狀與大小與目的物相差較大，而另一些雜質的分子形狀與大小可能與目的物相似，但在某條件下與目的物的電荷性質不同，在這種情況下，先用分子篩，用離心或膜過濾法除去分子量相差較大的雜質，然后在一定pH值和離子強度范圍下，使目的物變成有利的離子狀態，便能有效地進行層析分離。

在安排純化方法順序時，還要考慮到有利于減少工序，提高效率，如在鹽析后采取吸附法，必然會因離子過多而影響吸附效果，如增加透析除鹽，則使操作大大復雜化。如倒過來進行，先吸附，后鹽析就比較合理。

3．分離后期的保護性措施

在分離操作的后期必須注意避免產品的損失，主要損失途徑是器皿的吸附，操作過程樣品液體的殘留，空氣的氧化和某些事先無法了解的因素。為了取得足夠量的樣品，常常需要加大原材料的用量，并在后期純化工序中注意保持樣品溶液有較高的濃度，以防制備物在稀溶液中的變性，有時常加入一些電解質以保護生化物質的活性，減少樣品溶液在器皿中的殘留量。（三）分離純化方法的評估

每一個分離純化步驟的好壞，除了從分辨能力和重現性兩方面考慮外，還要注意方法本身的回收率，特別是制備某些含量很少的物質時，回收率的高低十分重要。一般經過5～6步提純后，活力回收在25％以上。但不同物質的穩定性不同、分離難易不同，回收率也不同。

對每一步驟方法的優劣的記錄，體現在所得產品重量及活性平衡關系上。這一關系，可通過每一步驟的分析鑒定求出。例如酶的分離純化，每一步驟產物重量與活性關系，通過測定酶的比活力及溶液中蛋白質濃度的比例。其他活性物質也可通過測定總活性的變化與樣品重量或體積與測出的活力列表進行對比分析，算出每步的提純倍數及回收率。

（四）生化產品純度的鑒定

一個制備物是否純，常以“均一性”表示。均一性是指所獲得的制備物只具有一種完全相同的成分，均一性的評價常須經過數種方法的驗證才能肯定。有時某一種測定方法認為該物質是均一的，但另一種測定方法卻可把它分成兩個甚至更多的組分，這就說明前一種鑒定方法所得的結果是片面的。如果某物質所具有的物理、化學等方面性質經過幾種高靈敏度方法的鑒定都是均一的，那么大致可以認為它是均一的。當然，隨著更好的鑒定方法的出現。還可能發現它不是均一的。絕對的標準只有把制備物的全部結構搞清楚，并經過人工合成證明具有相同生理活性時，才能肯定制備物是絕對純凈的。

生物分子純度的鑒定方法很多，常用的有溶解度法，化學組成分析法，電泳法，免疫學方法，離心沉降分析法，各種色譜法，生物功能測定法，以及質譜法等。第二部分實驗內容簡介豬血清γ-球蛋白分離純化及鑒定實驗一、

蛋白質的分離純化是研究蛋白質化學及其生物功能的重要手段。不同的蛋白質的分子量、溶解度、以及在一定條件下帶電的情況有所不同，可以更據這些性質的差別，分離及提純各種蛋白質。1.1內容提要免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig）是人體接受抗原刺激后，由漿細胞所產生的一類具有免疫功能的球狀蛋白質，是直接參與免疫反應的抗體蛋白的總稱。各種免疫球蛋白能特異地與相應的抗原結合形成抗原-抗體復合物（免疫復合物），從而阻斷抗原對人體的有害作用，對細菌等抗原的殺傷最后由補體去完成。

γ-球蛋白也稱為丙種球蛋白，相對分子量為15-16萬，沉降系數為7S；是一組在結構與功能上有密切關系蛋白質。楊據Ig的免疫化學特性，可分為五大類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，其分子不論哪一類，都由四鏈組成，即由兩條相同的長多肽鏈稱H鏈（又稱重鏈）及兩條相同的短肽鏈稱L鏈（又稱輕鏈）組成。機體大部分免疫功能力都依賴于IgG類免疫球蛋白，它約占免疫球蛋白總量的70-90%。IgG是人和動物血漿蛋白的重要組分之一，制備γ-球蛋白的原料通常用動物血液，其次還有動物胎盤和初乳乳清。制備方法有低溫乙醇法、利凡諾法、鹽析法、離子交換法等。

1.2實驗目標掌握免疫球蛋白（IgG

）的原理和方法

掌握利用紫外法、單向免疫擴散法等測定IgG含量的方法掌握SDS電泳法鑒定蛋白質純度及測定分子量方法掌握層析、透析、膜分離、電泳等生化分離鑒定技術的應用及操作1.3實驗要求掌握的技術柱層析分離技術SephadexG-25分子篩層析DEAE-Cellulose離子交換層析

蛋白質提取技術硫酸銨鹽析、透析、膜分離技術等蛋白質含量測定消光系數法、FOLin酚法測定IgG蛋白質含量蛋白質分子量、純度、活性測定SDS電泳法檢測、單向免疫擴散法豬脾臟DNA提取及含量鑒定實驗二、2.1內容提要

為了研究DNA分子在生命代謝中的作用，常常需要從不同的生物材料中提取DNA.由于DNA分子在生物體內的分布及含量不同，要選擇適當的材料提取DNA。動植物中，小牛胸腺、動物肝臟、魚類精子，植物種子的胚中都含有豐富的DNA。微生物中，谷氨酸菌體含7%－10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大腸肝菌含9%－10%。從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。對于低等生物。如從病毒中提取DNA比較容易，多數病毒DNA分子量較小，提取時易保持其結構完整性。從細菌及高等動植物中提取DNA難度大一些。細菌DNA分子量較大，一般達2×10道爾頓。因此易被機械張力剪斷。細菌DNA，除核DNA外，還有質粒DNA等。小牛胸腺

肝臟

魚類精子種子胚胎谷氨酸菌體（7%~10%）面包酵母（4%）

啤酒酵母（6%）

大腸肝菌（9%~10%）來源動物

植物

微生物2.1.1

DNA的基本功能生物遺傳信息復制的模板和基因轉錄的模板；

是生命遺傳繁殖的物質基礎，也是個體生命活動的基礎；

作為DNA分子中的某一區段，有復制、轉錄和翻譯等主要功能稱為基因。核酸（Nucleicacid）是以核苷酸為基本組成生物大分子。天然存在的核酸有兩類，一類為脫氧核糖核酸Deoxyribonucleicacid，DNA)，另一類為核糖核酸(Ribonucleicacid，RNA)。DNA存在于細胞核和線粒體中，攜帶遺傳信息。RNA存在于細胞質和細胞核內，參與細胞內DNA遺傳信息的表達。2.1.2核酸的結構與功能

天然狀態的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細胞核中。要從細胞中提取DNA時，先把DNP抽提出來，再把P除去，再除去細胞中的糖，RNA及無機離子等，從中分離DNA。2.1.3DNA存在形式2.1.4核酸的理化性質

RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。酸性溶液中，DNA、RNA易水解，中性或弱堿性溶液中較穩定。天然狀態的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細胞核中。要從細胞中提取DNA時，先把DNP抽提出來，再把P除去，再除去細胞中的糖，RNA及無機離子等，從中分離DNA。DNP和RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響而不同。DNP在低濃度鹽溶液中，幾乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化鈉溶解度最低，僅為在水中溶解度的1%，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2倍。RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/L氯化鈉中溶解度較大。因此，在提取時，常用此法分離這兩種核蛋白。2.1.5

細胞的破碎細菌有堅硬的細胞壁，首先要破碎細胞。方法有三種：①機械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；②化學試劑法：用SDS處理細胞；③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可使細胞壁破碎。由于高等動物DNA主要存在于細胞核與線粒體中，所以提取時