微生物的實驗室培養好用第1頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四課題1微生物的實驗室培養第2頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四第3頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四課程標準進行微生物的分離和培養。課標解讀1.知道培養基的基礎知識，進行無菌技術的操作。2.進行微生物培養。

第4頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四1．培養基

(1)培養基概念 按照微生物對

的不同需求，配制出供其

的營養基質。培養基的成分及無菌操作技術

營養物質生長繁殖第5頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四(2)培養基種類包括

培養基和

培養基等。(3)培養基的化學成分一般都含有

、

、

和

四類營養成分。還需要滿足微生物生長對

、

及

等的要求。固體液體水碳源氮源無機鹽pH特殊營養物質氧氣第6頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四2．無菌技術

(1)無菌技術圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括以下四個方面 ①對實驗操作的

、操作者的

，進行清潔和

； ②將用于微生物培養的器皿、

和

等進行

； ③為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在

附近進行； ④實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與

相接觸。空間衣著和手消毒接種用具培養基滅菌酒精燈火焰周圍的物品第7頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四(2)消毒和滅菌①消毒：消毒是指使用

方法僅殺死物體表面或內部一部分

的微生物，

(包括；不包括)芽孢和孢子，常用的方法有

消毒法、

消毒法、

消毒法。②滅菌：滅菌是指使用

殺死物體內外

，

(包括，不包括)芽孢和孢子，常用的方法有

滅菌、＿＿＿滅菌和

滅菌。較為溫和的物理或化學對人體有害不包括煮沸巴氏化學藥劑強烈的理化因素所有的微生物包括灼燒高壓蒸汽干熱第8頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四[思維激活1]

用酒精擦拭實驗者手臂屬消毒還是滅菌？70%與95%的酒精，哪一種效果更好？為什么？提示酒精擦拭屬化學消毒，酒精消毒時，70%的酒精殺菌效果最好。原因是：濃度過高，使菌體表面蛋白質凝固成一層保護膜，乙醇分子不能滲入其中；濃度過低，殺菌力減弱。第9頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四1．碳源、氮源及生長因子的來源與功能歸納營養要素來源功能碳源無機碳源CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳無機物①構成細胞物質和一些代謝產物；②有機碳既是碳源又是能源有機碳源糖類、脂質、蛋白質、有機酸、石油、花生粉餅等第10頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四氮源無機氮源無機氮：NH3、銨鹽、硝酸鹽、N2等將無機氮合成含氨的代謝產物有機氮源牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸合成蛋白質、核酸及含氮的代謝產物生長因子維生素、氨基酸、堿基①酶和核酸的組成成分；②參與代謝過程中的酶促反應第11頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四2.培養基類型劃分劃分標準培養基種類特點用途物理性質液體培養基不加凝固劑工業生產半固體培養基加凝固劑，如瓊脂觀察微生物的運動、分類鑒定固體培養基微生物分離、鑒定、活菌計數、保藏菌種化學成分天然培養基含化學成分不明確的天然物質工業生產合成培養基培養基成分明確(用化學成分已知的化學物質配成)分類、鑒定第12頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四用途選擇培養基培養基中加入某種化學物質，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長培養、分離出特定微生物(如培養酵母菌和霉菌，可在培養基中加入青霉素；培養金黃色葡萄球菌，可在培養基中加入高濃度食鹽)鑒別培養基根據微生物的代謝特點，在培養基中加入某種指示劑或化學藥品鑒別不同種類的微生物，如可用伊紅－美藍培養基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有，菌落呈現黑色，并帶有金屬光澤)第13頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四3.無菌技術(1)消毒和滅菌的區別條件結果常用的方法消毒較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外線或化學藥物消毒法滅菌強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌第14頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四(2)無菌技術主要操作要求①實驗前應對操作空間、操作人員消毒，對所用器具和培養基滅菌。②實驗進行時需在酒精燈火焰周圍無菌區操作，另外要避免已滅菌處理材料再次污染。第15頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四特別提示(1)微生物最常用的碳源是糖類，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是銨鹽、硝酸鹽。(2)對異養微生物來說，含C、H、O、N的有機物既是碳源，又是氮源、能源。(3)大凡對生長因子不能合成或合成能力有限的微生物，其培養基中均需額外添加生長因子，而許多微生物能自行合成生長因子，其培養基中不需再添加。第16頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四【鞏固1】

下列培養基配方中能作為選擇培養基、鑒別培養基的依次是 (

)。原料①②③④蛋白胨/g10101010乳糖/g5555蔗糖/g5555KH2PO4/g2222伊紅/g0.4美藍/g0.065瓊脂/g1020NaCl/g20蒸餾水/mL1000100010001000第17頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四A.①③B．②①C．②④D．③①解析高濃度的食鹽可以抑制多種細菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長，從而可以將金黃色葡萄球菌分離出來，有高濃度食鹽的培養基為選擇培養基。在培養基中加入伊紅和美藍，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌，有伊紅和美藍的培養基為鑒別培養基。答案D第18頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四1．制備牛肉膏蛋白胨固體培養基

(1)制備牛肉膏蛋白胨固體培養基的步驟：

→稱量→

→

→倒平板。

(2)倒平板的過程： ①在火焰旁右手拿錐形瓶，左手

。 ②右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過

。 ③左手將培養皿打開一條縫隙，右手將培養基倒入培養皿，左手立刻

。 ④待平板冷卻凝固后，將平板

放置，使皿蓋在下、皿底在上。培養基的制備與大腸桿菌的純化技術

計算溶化滅菌拔出棉塞火焰蓋上皿蓋倒過來第19頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四2．純化大腸桿菌

(1)微生物接種的最常用方法是

和

。

(2)平板劃線法：通過

在瓊脂固體培養基表面

的操作，將聚集的菌種

。

(3)稀釋涂布平板法：將菌液進行一系列的

，然后將不同稀釋度的菌液分別

，進行培養。當稀釋倍數足夠高時，即可獲得

。平板劃線法稀釋涂布平板法接種環連續劃線逐步稀釋分散到培養基的表面梯度稀釋涂布到瓊脂固體培養基的表面單個細菌形成的菌落第20頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四3．菌種的保存 為了保持菌種的純凈，需對菌種進行保藏。對于頻繁使用的菌種，我們可以采用

法；對于需要長期保存的菌種，可以采用

法。臨時保藏甘油管藏第21頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四[思維激活2]

除平板劃線法與稀釋涂布平板法外，還有哪些接種方法？微生物接種技術中最核心的內容是什么？提示微生物接種方法還有斜面接種及穿刺接種等方法，所有微生物接種方法中最核心的內容是“防止雜菌污染，保證培養物的純度”。第22頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四1．制備牛肉膏蛋白胨固體培養基 計算：依據牛肉膏蛋白胨培養基配方比例，計算配制100mL 的培養基時，各種成分的用量

稱量：牛肉膏比較黏稠，可用稱量紙稱取，牛肉膏和蛋白胨都 易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后要及時蓋上瓶蓋第23頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四第24頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四2．微生物分離與純化技術

(1)原理 微生物的分離與純化就是將待檢測微生物樣品通過劃線或涂布接種在固體培養基上，樣品中的每一個細胞或孢子都可以生長繁殖形成單個菌落。將單個菌落接種到斜面培養基上，經培養后，即可得到一個微生物的純種。第25頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四(2)方法步驟微生物的分離包括樣品稀釋、劃線或涂布及培養三個步驟①梯度稀釋操作(如圖1)圖1微生物分離操作流程圖第26頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四a．將分別盛有9mL水的6支試管滅菌，并按101～106的順序編號。b．用移液管吸取1mL已培養的菌懸液，注入第二支試管中。用手指輕壓移液管上的橡皮頭，吹吸三次，使菌懸液與水充分混勻。c．從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入102倍稀釋的試管中，重復第2步的操作。以此類推，直到完成最后一支試管的稀釋。注意：移液管需要經過滅菌。操作時，試管口和移液管應在離火焰1～2cm處。第27頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四②劃線或涂布平板劃線分離法：在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環，挑取大腸桿菌培養液在平板上劃線，常用的劃線方法有平行劃線和連續劃線兩種。平行劃線時，每轉一個角度燒一次接種環。劃線完畢后，蓋上培養皿蓋，做好標記。圖2劃線示意圖第28頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四涂布分離法：取3個平板，底面分別用記號筆寫上10－4、10－5和10－6三種稀釋度，然后用無菌吸管分別吸取相應稀釋度的稀釋液各0.1mL，放入已標記好的平板上，用無菌玻璃涂棒在培養基表面輕輕地涂布均勻，室溫下靜置5～10min，使菌懸液吸附進培養基(圖3)。③培養將劃線或涂布接種的平板倒置于培養箱或溫室中37℃培養16～24h，即可長出單菌落(圖4)第29頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四圖3涂布法示意圖圖4斜面接種法第30頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四(3)結果分析①確認培養基制備是否合格為確認培養基制備是否合格，需設置對照實驗，即接種后的培養基和一個未接種的培養基都放入37℃恒溫箱中，培養12h和24h，觀察現象并記錄——如果未接種的培養基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養基的制備是成功的，否則實驗失敗需要重新制備。第31頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四②接種操作成功的標準如果培養基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合該菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養基上出現了其他菌落，則說明接種過程中無菌操作還未達到要求，實驗失敗，需要分析原因，再次制備。第32頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四特別提醒(1)進行劃線時最后一區和第一區不可接觸。(2)平板劃線各次灼燒接種環的目的。平板劃線操作第一次劃線及每次劃線之前都需灼燒滅菌，劃線操作結束仍需灼燒接種環，每次灼燒目的不同。(3)灼燒接種環之后，要冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。第一次灼燒每次劃線之前灼燒劃線結束目的避免接種環上可能存在的微生物污染培養物灼燒殺死上次劃線結束后接種環上殘留的菌種，使每次劃線的菌種來自上次劃線末端劃線結束后殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者第33頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四【鞏固2】

下列有關平板劃線操作的敘述不正確的是 (

)。

A．第一步灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養物

B．每次劃線前，灼燒接種環是為了殺死上次劃線結束后，接種環上殘留的菌種

C．在第二區域內劃線時，接種環上的菌種直接來源于菌液

D．劃線結束后，灼燒接種環，能及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者第34頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四解析平板劃線操作中，接種環取菌種前灼燒的目的是避免接種環上可能存在的微生物污染培養物，以后每次劃線前灼燒接種環是為了殺死上次劃線后殘留的菌種。劃線結束仍需灼燒接種環，是為了能及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。從第二次劃線開始，每次劃線時接種環上的菌種直接來源于上次劃線的末端。答案C第35頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四【例1】

氯苯化合物是重要的有機化工原料，因其不易降解，會污染環境。某研究小組依照下列實驗方案(圖1)篩選出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。培養基配方如表1。微生物的營養與培養基類型

圖1第36頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四表1培養基的組成第37頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四(1)配制Ⅱ號固體培養基時，除添加Ⅱ號液體培養基成分外，還應添加1%的______。(2)培養基配制時，滅菌與調pH的先后順序是______。(3)從用途上來說，Ⅰ號培養基和Ⅱ號培養基分別屬于______培養基和______培養基。在Ⅱ號培養基中，為SP1菌提供氮源的成分是______。(4)在營養缺乏或環境惡劣時，SP1的菌體變成一個圓形的休眠體，這種休眠體被稱為______。第38頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四(5)將SP1菌接種在含不同濃度氯苯的Ⅲ號培養液中培養，得到生長曲線(如圖2)。從圖2可知，SP1菌在______培養條件下最早停止生長，其原因是_________________________________。圖2第39頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四思維導圖：第40頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四深度剖析本題考查培養基的配制原則以及微生物的實驗室培養過程，意在考查考生的圖表信息轉換與分析能力。(1)固體培養基中需加入瓊脂作為凝固劑。(2)先配制培養基后滅菌，調pH屬于培養基的配制過程，故先調pH后滅菌。(3)從用途上看，Ⅰ號培養基為通用培養基(基本培養基)；Ⅱ號培養基是選擇培養基，以氯苯為唯一的碳源，其中為SP1菌提供氮源的成分是硝酸銨。(4)芽孢是在細胞質內高度濃縮脫水形成的抗逆性很強的球形或橢圓形的休眠體。(5)由圖示可知SP1菌在20mg/L氯苯培養條件下最早停止生長，20mg/L氯苯可提供的碳源較少，碳源最早耗盡，影響菌體的生長繁殖。第41頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四答案(1)瓊脂(2)先調pH，后滅菌(3)通用選擇硝酸銨(4)芽孢(5)20mg/L氯苯碳源最早耗盡[誤區警示](1)瓊脂是最常用的凝固劑，但固體培養基未必均加瓊脂，如棉子殼培養基也屬固體培養基。(2)牛肉膏、蛋白胨等天然物質既可提供碳源，也可提供氮源及生長因子。第42頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四【例2】

培養基、培養皿、接種環、實驗操作者的雙手、空氣、牛奶所采用的滅菌、消毒方法依次是 (

)。 ①化學消毒②灼燒滅菌③干熱滅菌④紫外線滅菌⑤高壓蒸汽滅菌⑥巴氏消毒法

A．⑤③②①④⑥ B．①②③④⑤⑥

C．⑥②③④①⑤ D．③④②①⑥⑤無菌操作技術

思維導圖：第43頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四深度剖析培養基用高壓蒸汽滅菌；培養皿能耐高溫，需用干熱滅菌；接種環可用灼燒滅菌達到迅速徹底的滅菌效果；實驗操作者的雙手可用化學藥劑進行消毒，如用酒精擦拭雙手；空氣可用紫外線消毒；牛奶為不破壞其營養成分可采用巴氏消毒法。答案A第44頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四[思維深化]幾種常用滅菌方法比較(見下表)方法滅菌操作適用對象灼燒滅菌在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒對接種環、接種針或其他金屬工具滅菌，也可以對試管口、瓶口滅菌干熱滅菌在干熱滅菌箱內，160～170℃條件下，加熱1～2h耐高溫且需保持干燥的物品，如玻璃器皿和金屬用具等高壓蒸汽滅菌在高壓蒸汽滅菌鍋內，121℃，100kPa，滅菌15～30min培養基、發酵設備等紫外線滅菌30W照射30min小型接種室、接種箱等第45頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四【例3】

如圖是微生物平板劃線示意圖，劃線的順序為12345。下列操作方法正確的是 (

)。

A．操作前要將接種環放在火焰邊灼燒滅菌

B．劃線操作須在火焰上進行

C．在5區域中才可以得到所需菌落

D．在12345區域中劃線前后都要對接種環滅菌微生物純化培養

第46頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四深度剖析本題考查平板劃線的操作方法。在每次劃線前后都要對接種環進行滅菌，接種環的滅菌方法應是在火焰上灼燒，接種時劃線操作是在火焰邊進行。在5個區域中，只要有單個活細菌，通過培養即可獲得所需菌落。答案D第47頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四[歸納提升](1)倒平板時不要將培養基濺在皿蓋與皿底之間，否則此培養基不能用來培養微生物。(2)平板倒置原因：平板皿蓋上會凝結水珠，培養基表面的溫度也較高，平板倒置后，既可使培養基表面的水分更好地揮發，又可防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。(3)兩種純化方法的比較第48頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四項目優點缺點適用范圍平板劃線法可以觀察菌落特征，對混合菌進行分離不能計數適用于好氧菌稀釋涂布平板法可以計數，可以觀察菌落特征吸收量較少，較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延適用于厭氧菌和兼性厭氧菌第49頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四單擊此處進入隨堂達標檢測第50頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四旁欄思考題1．無菌技術除了用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？解析許多微生物對人類是有害的，因此實驗室中無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。答案無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。第51頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四2．請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。(1)培養細菌用的培養基與培養皿。(2)玻璃試管、燒瓶和吸管。(3)實驗操作者的雙手。解析消毒和滅菌是無菌技術的兩項基本技術，實踐中需要根據無菌操作的對象合理地選擇使用。原則是既要考慮使用的效果，又要考慮無菌操作對象的承受能力。答案(1)、(2)需要滅菌；(3)需要消毒。第52頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四倒平板操作討論題1．培養基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的溫度？答案可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2．為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答案通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。第53頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四3．平板冷凝后，為什么要將平板倒置？答案平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養基表面的