第三章碳水化合物的測定

CarbohydratesDetermination第二節水溶性糖的測定水溶性糖的測定

單糖含有α羥基酮或α羥基醛，具有還原的特性，稱為還原糖；蔗糖不具有還原性，稱非還原糖。但蔗糖(雙糖)經水解為單糖后，就又具有還原性。

糖的還原性質與測定方法密切相關

還原糖的測定方法：質量法、容量法、比色法及旋光法質量法：是以還原糖將費林試劑還原產生Cu2O稱量為基礎的經典法。還原糖含量高的樣品才使用。

容量法：按所用氧化劑不同可分為銅還原法和鐵還原法兩類。前者常用費林試劑為氧化劑，后者用鐵氰化鹽的堿性溶液為氧化劑。還原糖與氧化劑的反應很復雜，須嚴格按照操作進行。一、還原糖的測定

（一）銅還原直接滴定法

1、原理：還原糖可使斐林試劑還原生成Cu2O沉淀，而本身被氧化成糖酸。

2．注意事項：

（1）斐林試劑由硫酸銅（CuSO4·5H2O（A液），酒石酸鉀鈉及氫氧化鈉（B液）組成，不能混合存放。（2）無色的還原型亞甲基藍極易被大氣中的02所氧化，恢復原來的藍色，故整個滴定過程中三角瓶不能離開電爐，使瓶中的溶液始終保持沸騰狀態，液面覆蓋水蒸氣，不與空氣接觸。

（3）滴定至終點指示劑被還原糖所還原，藍色消失，呈淡黃色。稍放置接觸空氣中氧指示劑被氧化，又重新變成藍色，此時不應再滴定。

（4）糖液待測液的制備須除去蛋白質的干擾（滴定干擾），澄清劑：中性、堿性醋酸鉛（果蔬等含酸大的）硫酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液（蛋白質高的提取液）。

（5）澄清劑不能過量，否則會使分析結果失真，鉛與糖生成鉛糖。要加入除鉛劑，如硫酸鈉，草酸鈉（鉀），磷酸氫二鉀等。

（6）含有機酸多的樣品，如果蔬，浸提時可能使得蔗糖水解，造成正誤差，故浸提時加CaCO3中和。（9）水浴（制備待測液的）不能超過80℃，75-80℃，否則容易引起還原糖的水解。

（10）本法對滴定操作條件要求很嚴，對堿性酒石酸鉀鈉溶液的標定，樣品液必須預測，樣品液測定的操作條件與預測條件應保持一致。

（11）滴定過程要控制在3min內。

（12）本方法測定的是一類具有還原性質的糖，包括葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖等，只是結果用葡萄糖或其他轉化糖的方式表示，所以不能誤解為還原糖=葡萄糖或其它糖。但如果已知樣品中只含有某一種糖，則可以認為還原糖=某糖。（13）分別用葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖標準品配制標準溶液分別滴定等量已標定的費林氏液，所消耗標準溶液的體積有所不同。證明即便同是還原糖，在物化性質上仍有所差別，所以還原糖的結果只是反映樣品整體情況，并不完全等于各還原糖含量之和。（二）氰化鹽碘量法

1、原理

（1）還原糖與已知過量的鐵氰化鉀堿性溶液作用，生成亞鐵氰化鉀和糖酸（2）過量的鐵氰化鉀在HOAc存在下與KI作用，生成游離的I2。（3）最后用標準Na2S203溶液滴定生成的I2，以淀粉為指示劑。

由于反應是可逆的，為了使反應順向定量的進行，用硫酸鋅沉淀反應所生成的低鐵氰化鉀。

根據空白值與樣品值的差計算消耗的鐵氰化鉀的體積，從而得到樣品還原糖的含量（相當葡萄糖的量）。（4）根據樣品的含糖量選擇稀釋倍數，使最終供使糖液濃度在1.0-2.5mg/100ml之間（5）硫代硫酸鈉極易分解

,防止措施；A．在溶液中加入少量硼砂，能抑制微生物的生長。B．配制溶液的蒸餾水在臨用前煮沸。C．要貯存在棕色瓶中．盡可能避免接觸空氣。D.應該每隔一定時間應重新加以標定。（三）銅還原碘量法（Somogyi法）

1、原理：

（1）還原糖與索姆吉試劑（與斐林試劑相似）作用產生Cu2O

（2）酸化溶解Cu2O成Cu＋，并與過量的I2作用（3）最后用標準Na2S203溶液滴定生成的I2，以淀粉為指示劑。利用空白與樣品的差值，計算消耗的Na2S203體積，查表得到還原糖量。（4）銅還原碘量法要求樣品必須是沒有色素的中性澄清液體，提取糖分時制樣復雜，若樣品色素含量高，影響試驗者對終點的判斷，也使測定結果不準確。

（5）滴定至溶液由藍色突變為亮綠色（Cr3＋的顏色）為終點。滴定時溶液呈現二價銅離子的淺藍色，切勿將它與終點混淆。（四）高錳酸鉀容量法

1、原理：

還原糖與過量的斐林試劑反應生成Cu2O，在酸性條件下，氧化亞銅能使硫酸鐵還原為硫酸亞鐵，再用KMNO4溶液滴定硫酸亞鐵，由KMnO4標準溶液滴定量換算成Cu，查表，即可標出還原糖的量。本法為國標GB5009.7-85方法，適用于所有食品中還原糖的測定及通過酸水解或酶水解轉化為還原糖的非還原性糖類物質的測定。準確度和重現性均優于直接滴定法3、操作（1）樣品處理處理CO2：吸樣液50ml，水浴加熱→于100ml容量瓶，加水至刻度定容→可測還原糖及蔗糖。（2）樣品測定取50ml處理的樣液→于400ml燒杯→加A、B液各25ml→加熱在4min左右沸騰→再煮2min→趁熱抽濾→用60℃水洗燒杯和沉淀→直到洗液不成堿性→將抽濾的紙（或者石棉）及Cu2O→轉入原來燒杯→用25ml硫酸鐵溶液沖洗古氏坩堝→使沖洗液全部洗入原燒杯中→加水25ml→使Cu2O溶解→用0.1NKMnO4標液滴定至微紅色，同時用50ml水按上述方法做空白實驗。

（2）煮沸后溶液應保持藍色，使堿性酒石酸銅過量，使還原糖完全反應。煮沸后的溶液顯紅色不顯蘭色，則表示糖量高，可減少試樣體積,另做，而不能增加堿性酒石酸銅甲、乙液的用量。

（3）在洗滌Cu2O的整個過程中應使沉淀上層保持一層水層，以隔絕空氣，避免Cu2O被空氣中的氧所氧化。（4）樣品的處理：應除去蛋白質、脂肪、乙醇、二氫化碳、纖維素和淀粉等。

（5）適于還原糖含糖量高的樣品的測定，有色樣液不受限制，準確度高，重現性好。準確性和重現性都優于直接滴定法，但流程長、步驟多、操作繁雜、消耗大，耗時費力，需使用特制的高錳酸鉀法糖類檢索表,不適合于大批量樣品的測定工作。（6）在古氏坩堝中鋪好精制石棉，以免使氧化亞銅損失。

（7）0.02mol／L（1/5KMnO4）溶液的配制與標定

（8）樣品中的還原糖既有單糖也有麥芽糖或乳糖等雙糖時，還原糖的測定結果會偏低。

（9）此法以測定反應過程中產生的定量的亞鐵離子為計算依據，因此在樣品處理時，不能用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀作澄清劑，以免引入亞鐵離子。（9）此法以測定反應過程中產生的定量的亞鐵離子為計算依據，因此在樣品處理時，不能用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀作澄清劑，以免引入亞鐵離子。（10）當樣品中的還原糖有雙糖時，由于這些雙糖的分子中僅有一個還原基，測定結果將偏低。（五）比色法

1．砷鉬藍比色法(Somogyi比色法)

（1）原理：利用斐林試劑與還原糖產生Cu2O，Cu2O再將鉬還原產生的藍色，在濃硫酸存在的條件下與砷鉬酸生成藍色復合物——砷鉬藍，其顏色深淺在一定范圍內與還原糖的含量（即被還原的Cu2O量）成正比。用標準葡萄糖與砷鉬酸作用，比色后做標準，就可測得樣品還原糖含量。比色的波長：560，620nm，測定范圍：10-180ug/ml，以25-50μg/ml最好。

Cu2O+H2SO4Cu+

2Cu++MoO42-+SO42-2Cu2++藍色復合物（2）注意：

a．適于還原糖和可溶性糖總量的測定，適于范圍10-180μg/ml，可用于微量的測定。與經典方法相比，快速，省時，操作簡便，試劑消耗少，靈敏度高。

b．產物穩定，不需要脫色和脫蛋白。2．蒽酮法比色法

（1）原理：糖在濃硫酸作用下，可經脫水后與蒽酮縮合成藍綠色化合物，在一定范圍內，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量測定。

620nm處比色（2）注意：

a．不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深（藍綠色），葡萄糖次之（黃綠色），蔗糖生成的顏色為草綠色（介于二者之間）半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時，則可避免此種誤差。b．因為可與可溶性糖中的任何一組分都能反應生成有顏色的化合物，所以該法適于農產品中可溶性糖總量的測定。

C．由于以上原因，該法精度較砷鉬藍比色法低。

d.操作過程中要保證各試樣條件的一致性，否則易引起較大的誤差：搖動的時間，加熱，冷卻的時間。e.糖的浸提的溫度和時間須嚴格執行，另外，也可用水做浸提劑，在75-80度的水浴中提取，但須除去蛋白質的干擾。為了避免淀粉等的影響，樣品須用80％酒精提取。

f.蛋白質干擾顯色，特別是色氨酸干擾顯色，本法不適于蛋白質含量高的樣品糖分的測定。g．本比色要求含糖量在20-80μg/ml的范圍內較適宜。

h．顯色液超過標準曲線后，不能直接稀釋，否則會引起沉淀，只能稀釋待測液后再測定，或與蒽酮，待測液同比例稀釋，注意先加蒽酮試劑，再加水。

I．蒽酮試劑須現用現配，否則易形成沉淀，引起較大的誤差。24小時以內。j.在反應系統中，供測試液與蒽酮&濃硫酸溶液的最適體積比為1:5，以保證糖能夠充分顯色。

k.應注意的是濃硫酸有腐蝕作用。

二、水溶性總糖的測定

農產品中通常含有多種糖類，有具還原性的葡萄糖、果糖、麥芽糖和乳糖等糖類，也有不具還原性的蔗糖等糖類。對這些糖分別加以測定是困難的，通常也是沒有必要的。農產品生產中通常要測定其總量。因此提出“總糖”的概念。

總糖主要指具有還原性的糖(葡萄糖、果糖、乳糖和麥芽糖等)和在測定條件下能水解為還原性單糖的蔗糖的總量。它與生物化學中所說的總糖不同，它不包括淀粉等多糖物質，因在測定條件下，淀粉等多糖的水解作用很微弱。（一）、滴定法：

原理：

植物性水溶性糖浸出液中包括葡萄糖、果糖和蔗糖。蔗糖必須經稀HCl水解生成轉化糖（等量的葡萄糖和果糖）后與原有的還原糖一起測定，即為水溶性總糖，可以直接用直接滴定法或高錳酸鉀容量法或銅還原碘量法（Somogyi法）測定。注意事項：

（1）測定中應嚴格控制水解條件，既要保證蔗糖的完全水解又要避免其他多糖的分解。水解結束后應立即取出，迅速冷卻中和。

（2）總糖測定結果一般以轉化糖計。為減少誤差，堿性酒石酸銅溶液的標定需采用蔗糖標準溶液，可用葡萄糖表示,費林試劑需另用葡萄糖標定。三、蔗糖的測定

甘蔗品質分析中蔗汁蔗糖分是最重要的分析項目。蔗糖是由α-D-吡喃葡萄糖的苷羥基和β-D-呋喃果糖的苷羥基脫水而成。

其結構如下：1.原理

樣品經除去蛋白質后，其中蔗糖經鹽酸水解轉化為還原糖，再按還原糖測定方法測定，水解前后還原糖的差值，為蔗糖含量.實際上測定還原糖包括兩部分：一是樣品中原有的還原糖、二是蔗糖經酸水解后的還原糖。3.注意

（1）蔗糖在本法規定的水解條件下，可以完全水解，而其他雙糖和淀粉等的水解作用很小。所以必須嚴格控制水解條件，以確保結果的準確性與重現性。此外果糖在酸性溶液中易分解，故水解結束后應立即取出并迅速冷卻中和。（2）應測定水解前樣品中還原糖的量，水解后增加的還原糖的量為蔗糖水解產生的。

（3）根據蔗糖的水解反應方程式：

蔗糖的相對分子質量為342，水解后生成2分子單糖，其相對分子質量之和為360。蔗糖水解物中增加了一分子水，使產物總量增大。（4）用還原糖法測定蔗糖時，為減少誤差，測得的還原糖應以轉化糖（D-葡萄糖和D-果糖的混合物,由于水解前后旋光度發生改變（由右旋變為左旋），所以蔗糖的水解產物叫做轉化糖）表示，故，用直接法滴定時，堿性酒石酸銅溶液的標定需采用蔗糖標準溶液按測定條件水解后進行標定。（5）若選用高錳酸鉀滴定時，查附表時應查轉化糖項

342/360＝0.95

即1g轉化糖相當于0.95g蔗糖量（二）旋光法

1、方法原理

甘蔗和甜菜等作物所含的糖幾乎全是蔗糖。

旋光法測糖的原理是基于糖類分子具有不對稱碳原子，可使通過的光的偏振面旋轉。當光的波長、溫度和液層厚度一定時，溶液中蔗糖的濃度與偏振光面旋轉角度成正比。因此，可用旋光計或檢糖計測定蔗糖的含量。各種糖類都有其特定的比旋，例如蔗糖水溶液的比旋[α]D20是指+66.5，葡萄糖是+52.8，果糖是-92.8，麥芽糖是+118等。2.注意事項：

（1）糖液待測液的制取的水浴溫度不能超過80℃。

（2）除去蛋白質用堿性醋酸鉛。該液為膠體，