本文格式為Word版，下載可任意編輯——抗菌藥物敏感性試驗及細節耐藥檢測抗菌藥物敏感性試驗與細節耐藥性監測

來源：檢驗醫學在線2023-4-15南網編輯2023-7-6

一、需氧菌及兼性厭氧菌的藥物敏感試驗

(一)紙片瓊脂擴散法

紙片瓊脂擴散法又稱Kirby-Bauer試驗，是操作最簡易、使用最廣泛的抗菌藥物敏感性試驗。

1．試驗原理將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上。紙片中所含的藥物吸收瓊脂中的水分溶解后不斷向紙片周邊區域擴散形成遞減的梯度濃度。在紙片周邊抑菌濃度范圍內測試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度(MIC)呈負相關關系，即抑菌圈越大，MIC越小。

2．培養基和抗菌藥物紙片

(1)培養基：水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton，MH)培養基是CLSI/NCCLS采用的兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗標準培養基，pH值為7.2～7.4，對那些營養要求高的細菌如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、鏈球菌等需參與補充物質。瓊脂厚度為4mm。配制瓊脂平板當天使用或置塑料密封袋中4℃保存，使用前應將平板置35℃孵育箱孵育，使其表面枯燥。(2)抗菌藥物紙片：選擇直徑為6.35mm，吸水量為20ul的專用藥敏紙片用逐片加樣或浸泡方法使每片含量達到規定所示。含藥紙片密封儲存2～8℃或-20℃無霜冷凍箱內保存，β-內酰胺類藥敏紙片應冷凍儲存，且不超過l周。使用前將儲存容器移至室溫平衡l～2h，避免開啟儲存容器時產生冷凝水。

3．細菌接種細菌接種采用直接菌落或細菌液體生長方法。用0.5麥氏比濁標準的菌液濃度。校正濃度后的菌液應在15min內接種完畢。接種步驟如下：①用無菌棉拭子蘸取菌液，在管內壁將多余菌液旋轉擠去后，在瓊脂表面均勻涂片接種3次，每次旋轉60°，最終沿平板內緣涂抹1周；②平板置室溫下枯燥3～5min，用紙片分開器或無菌鑷將含藥紙片緊貼于瓊脂表面；③置35℃孵育箱孵育16～18h后閱讀結果，對甲氧西林和萬古霉素藥敏感試驗結果應孵育24h。

4．結果判斷和報告用確切度為1mm的游標卡尺量取抑菌圈直徑(抑菌圈的邊緣應是無明顯細菌生長的區域)，當葡萄球菌對苯唑西林的藥敏試驗或腸球菌對萬古霉素的敏感試驗，圍繞紙片周邊只要有極少細菌生長提醒為耐藥。對另外一些菌，在抑菌圈內散在菌落生長提醒可能是混合培養，必需再分開鑒定及試驗，也可能提醒為高頻突變株。變形桿菌遷徙生長使抑菌圈內生成的薄層菌可忽略不計。由于培養基內抗藥成分使其對甲氧芐啶引起的微弱細菌生長，生長層小于20％可忽略不計。根據CLSI/NCCLS標準，對量取的抑菌圈直徑判斷病原菌對該藥物的敏感性形式(敏感/中度敏感/中介、耐藥)。

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(二)稀釋法

假使要進一步檢測某種病原菌對多少劑量(濃度)的抗菌藥物呈敏感時，就必需使用稀釋法(dilutionmethod)。稀釋法包括兩

種：肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法，分別介紹如下：

1．肉湯稀釋法有常量稀釋法(mac-rodilution)和微量稀釋法(microdilution)，前者含藥肉湯含量每管≥l.0ml(尋常2m1)，后者每孔含0.1ml。商品化的微量稀釋板上含有多種經對倍系列稀釋的凍干抗生素，操作便利，廣泛應用于臨床。

(1)培養基：使用M-H肉湯，需氧菌、兼性厭氧菌在此培養基中生長良好。在該培養液中參與補充基質可支持流感嗜血桿菌、鏈球菌生長。培養基制備完畢后應校正pH值為7.2～7.4(25℃)。離子校正的M-H肉湯(CAMHB)為目前推薦的藥敏試驗培養液。

(2)藥物稀釋①藥物原液制備：抗菌藥物直接購自于廠商或相關機構，所需的溶液量或粉劑量可根據下述兩公式進行計算。

質量(mg)=溶劑（ml）×濃度（ug/ml）/分析效能（ug/mg）容積(m1)=質量(mg)×分析效能（ug/mg）/濃度（ug/ml）

配制各種抗菌藥物的溶劑根據藥物性能選擇蒸餾水、pH值為6.0，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液等。

一般原液濃度不低于1000ug/ml或10倍于最高測試濃度，原液應儲存于-60℃以下，保存期不超過6個月。②稀釋抗菌藥物的制備：行2倍系列稀釋，使其終濃度(ug/m1)為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0、0.5、0.25、0.125等。

(3)菌種接種：配制0．5麥氏濃度菌液，用肉湯(常量稀釋法)、蒸餾水或生理鹽水(微量稀釋法)稀釋菌液，使最終菌液濃度(每管或每孔)為5×10CFU／ml，稀釋菌液于15min內接種完畢，35℃孵育16～20h，當試驗菌為嗜血桿菌屬、鏈球菌屬孵育時間為20～24h，試驗葡萄球菌和腸球菌對苯唑西林和萬古霉素的藥敏試驗孵育時間必需滿24h以上。(4)結果判斷：以在試管內或小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC(ug/m1)。甲氧芐啶(甲氧芐胺嘧啶)或磺胺藥物的肉湯稀釋法敏感試驗的終點判斷，以細菌數為陽性對照的80％即可作為判斷細菌生長指標。微量稀釋法時，常借助于比濁計判別是否有細菌生長。

2．瓊脂稀釋法瓊脂稀釋法是將藥物混勻于瓊脂培養基中，配制含不同濃度藥物平板，使用多頭接種器接種細菌，經孵育后觀測細菌生長狀況，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含藥物濃度測得MIC。

(1)培養基：M-H瓊脂為一般菌藥敏試驗的最正確培養基，調整pH值在7.2～7.4(25℃)，過高或過低的pH值會影響藥物效能。

(2)含藥瓊脂制備：將已稀釋的抗菌藥物按1：9(配制的藥物溶液：瓊脂培養基)參與，加熱溶解瓊脂，在45～50℃水浴平衡溶化MH瓊脂中，充分混合傾入平皿，瓊脂厚度為3～4mm。室溫凝固后的平皿裝入密閉塑料袋中，置2～8℃，儲存日期為5d，對易降解藥物如含

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頭孢克洛，在使用48h之內制備平板，使用前應在室溫中平穩放于孵育箱或層流罩中30min以使瓊脂表面枯燥。

(3)細菌接種：將0.5麥氏比濁度菌液稀釋10倍，以多頭接種器吸取(為1～2ul)接種于瓊脂表面，稀釋的菌液于l5min內接種完畢，接種后置35℃孵育16～20h(MRS、VRE孵育時間需滿24h)，奈瑟菌屬、鏈球菌屬細菌置于5％C02、幽門螺桿菌置微需氧環境中孵育。(4)結果判斷：將平板置于暗色、無反光表面上判斷試驗終點，以抑制細菌生長的藥物稀釋度為終點濃度(含甲氧芐啶平板上可見少許散在細菌生長)。試驗菌的結果報告可用MIC(ug/mg)或用敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)報告。(三)E試驗

E試驗(Epsilometertest)是一結合稀釋法和擴散法原理對細菌藥敏試驗直接定量的技術。

1．試驗原理E試條是一條5mm×50mm的無孔試劑載體，一面固定有一系列預先制備的，濃度呈連續指數增長稀釋抗生素，另一面有讀數和判別的刻度?？股氐奶荻瓤筛采w有20個MIC對倍稀釋濃度的寬度范圍，其斜率和濃度范圍對判斷有臨床意義的MIC范圍和分界點值具有較好的關聯。

將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗生素抑制細菌的特定濃度，又稱抑制濃度(IC)，它與MIC呈高度相關。

2．細茵接種和加樣使用厚度為4mmM-H瓊脂平板，用0.5麥氏濃度的對數期菌液涂布，待瓊脂平板完全枯燥，用E試驗加樣器或鑷子將試條放在已接種細菌的平板表面，試條全長應與瓊脂平板緊湊接觸，試條MIC刻度面朝上，濃度最大處靠平板邊緣。采用CLSl/NCCLSAST執行標準推薦孵育條件。

3．結果判斷和報告讀取橢圓環與E試驗試條的交界點IC值。E試驗IC值與CLSl/NCCLS的稀釋法MIC參考值高度相關，二者直接相對應，CLSl/NCCLSMIC折點值適用于E試驗。但在判斷結果時出現和細菌、藥物、耐藥機制和技術處理有關判斷問題時應予以修正。

二、苛養菌的藥物敏感試驗

肺炎鏈球菌及其鏈球菌屬、流感嗜血桿菌、奈瑟菌屬等苛養菌不能在普通環境及普通MH培養基中快速生長，上述的藥敏試驗條件不適合它們。它們需要更為繁雜的培養基、孵育條件，在進行藥敏試驗時，質控菌株、藥敏抗生素的選擇、結果解釋標準也有所不同。下面分別介紹幾種重要苛養菌藥敏試驗的試驗條件選擇、質量控制方法和結果判斷本卷須知。各自的結果判斷標準請參考CLSl/NCCLS手冊。(一)嗜血桿菌屬1．試驗條件

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(1)培養基：使用嗜血桿菌屬試驗培養基(hemophilustestmedium，HTM)。(2)接種菌液：菌懸液終濃度為5×10CFU/ml。

(3)孵育條件：35℃下孵育20～24h觀測結果。對于擴散法，35℃、5％～7％C02下孵育l6～18h觀測結果。

2．質量控制流感嗜血桿菌ATCC49247、流感嗜血桿菌ATCC49766、大腸埃希菌ATCC35218(用于β-內酰胺抗生素/β-內酰胺酶抑制劑)為推薦參考菌株。3．結果判斷本卷須知

(1)血液、腦脊液分開株僅需做氨芐西林、三代頭孢菌素中的一種、氯霉素和美羅培南。(2)耐氨芐西林和阿莫西林的流感嗜血桿菌大多產TEM型β-內酰胺酶。大多數狀況下，直接檢測β-內酰胺酶更快。

(3)β-內酰胺酶陰性而氨芐西林耐藥(β-Lactmase-negative，ampicillin-resistant，BL-NAR)的流感嗜血桿菌株少見。然而，不管其體外藥敏試驗是否出現敏感，均應考慮為阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、頭孢克洛、頭孢盂多、頭孢尼西、哌拉西林/他唑巴坦耐藥。

(二)肺炎鏈球菌1．試驗條件

(1)培養基：肉湯稀釋法使用離子校正的馬凍融血培養基。(2)接種菌液：菌懸液終濃度為l0CFU/ml。(3)孵育條件：35℃下孵育20～24h。

2．質量控制肺炎鏈球菌ATCC49619、大腸埃希菌ATCC35218(用于β-內酰胺抗生素/β-內酰胺酶抑制劑)為推薦參考菌株。3．結果判斷本卷須知

(1)對青霉素敏感者，均可認為對氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、阿莫西林／舒巴坦、頭孢克洛等三代頭孢菌素敏感；青霉素中介或耐藥株，不推薦做上述藥物的藥敏試驗，由于對青霉素耐藥的肺炎鏈球菌對上述抗生素治療的療效很低。應當及時通知臨床醫生，然后應報告對頭孢曲松、頭孢噻肟和美羅培南的MIC。

(2)靜脈注射高濃度青霉素(腎功能正常的成人2×10U/4h)或氨芐西林(29/6h)對青霉素中介的肺炎鏈球菌是有效的。標準劑量的頭孢曲松、頭孢噻肟對中介的肺炎鏈球菌也有臨床療效，但在發現該菌株引起的腦膜炎時常用最大劑量治療。(三)肺炎鏈球菌外鏈球菌屬1．試驗條件

(1)培養基：肉湯稀釋法同肺炎鏈球菌，瓊脂稀釋法用含5％羊血瓊脂。(2)接種菌液：菌懸液終濃度為5×10CFU/ml。

(3)孵育條件：35℃下孵育20～24h。瓊脂稀釋法需5％C0。。2．質量控制肺炎鏈球菌ATCC49619為推薦質控菌株。

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3．結果判斷本卷須知

(1)化膿性鏈球菌一般不需做青霉素藥敏試驗，該菌目前對青霉素仍為敏感株，只有某些無乳鏈球菌可能會對青霉素產生中介結果。

(2)對青霉素敏感的鏈球菌，同時被認為對氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、阿莫西林/舒巴坦、頭孢克洛、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢唑肟等敏感，毋需對這些抗生素進行藥敏試驗。

(3)青霉素或氨芐西林中介的菌株，需用氨基糖苷類聯合用藥進行治療。

(4)對紅霉素耐藥者或敏感者常提醒對阿奇霉素、克拉霉素、地紅霉素耐藥或敏感。

三、分枝桿菌的藥物敏感試驗

(一)結核及慢生長分枝桿菌的藥物敏感試驗

由于結核及慢生長分枝桿菌生長緩慢，在生長前，藥物已擴散至培養基中，不能有效影響其生長。故不適用于需氧或兼性厭氧菌的藥敏試驗。結核及慢生長分枝桿菌藥敏試驗的藥敏培養基、含藥濃度、接種菌量、結果解釋等都有其特別性。

比例法是WH0/IUATLD全球結核病耐藥監測方案中推薦的方法，目前國外普遍采用此法。國內多采用絕對濃度法，據報道，該法比比例法的耐藥菌檢出率要低5％～10％。某些微生物自動鑒定和藥敏系統則采用放射核素等方法。

1．絕對濃度法(absoluteconcentrationmethod)該法以“無生長〞為終點或為最低抑菌濃度(MIC)來判斷耐藥與否，每種藥物需制備兩種不同濃度的含藥培養基，同時用不含藥培養基作