分子生物學實驗第1頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四實驗目錄實驗一植物基因組DNA提取及純化實驗二PCR克隆目的基因實驗三PCR產物瓊脂糖凝膠電泳實驗四PCR產物凝膠回收實驗五目的基因片段與載體連接實驗六E.coliDH5α和DE3感受態細胞制備實驗七連接產物轉化轉化大腸桿菌實驗八陽性單菌落篩選實驗九重組質粒DNA提取實驗十重組質粒及表達載體pET酶切分析與電泳實驗十一目的片段回收及與表達載體連接實驗十二連接產物轉化DH5α,質粒提取實驗十三陽性質粒轉化表達菌株BL21實驗十四蛋白質的誘導表達及蛋白質樣品制備實驗十五SDS檢測誘導表達的蛋白質第2頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四實驗一植物基因組DNA提取

基本原理

1.基因組DNA的提取通常用于構建基因組文庫、Southern雜交及PCR分離基因等。

2.不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同;不同種類或同一種類的不同組織因其細胞結構及所含的成分不同，分離方法也有差異。

3.在提取某種特殊組織的DNA時必須參照文獻和經驗建立相應的提取方法,以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酚類物質對隨后的酶切、PCR反應等有較強的抑制作用,因此用富含這類物質的材料提取基因組DNA時,應考慮除去多糖和酚類物質。第3頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四4.核酸是生物有機體中的重要成分，在生物體中核酸通常與蛋白質結合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分為DNA和RNA，在真核生物中，前者主要存在于細胞核中，后者主要存在于細胞質和核仁里。在制備核酸時，通過研磨破壞細胞壁和細胞膜，使核蛋白被釋放出來。第4頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四5.植物基因組DNA的提取程序：（1）破碎組織（2）破壞細胞膜（3）去除雜質（4）沉淀基因組DNA第5頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四6.DNA的檢測方法（1）紫外分光光度法（2）電泳檢測DNA的質量

第6頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四本實驗是通過SDS法提取擬南芥基因組DNA。第7頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四1.通過SDS提取擬南芥基因組DNA;2.為從擬南芥基因組DNA克隆目的基因作準備二實驗目的第8頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四儀器及耗材：研缽、微量移液器及吸頭、EP管、臺式離心機。材料：擬南芥小苗試劑：DNAExtractBuffer(0.2MNaCl,25mMEDTA,0.5%SDS,pH7.5);70%乙醇；酚；氯仿；異丙醇;RNase儀器、材料和試劑第9頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四實驗步驟1.取一定量的擬南芥組織;2.加入600μl抽提緩沖液（0.2MNaCl,25mMEDTA,0.5%SDS,pH7.5），室溫下快速研磨;3.把抽提液從研缽中移至1.5ml離心管中，混勻;4.12,000rpm,離心10min(RT)。取上清，加等體積的酚/氯仿（1：1）混合液，上下顛倒混勻；5.12,000rpm,5min(RT)，取上清，加等體積的異丙醇，上下顛倒混勻；6.12,000rpm,10min(RT)，棄上清，倒置于吸水紙上待壁上液體流盡后加入1ml的70%乙醇洗沉淀；7.12,000rpm,5min(RT)，棄上清，倒置于紙巾上待其干燥；8加20μlddH2O溶解沉淀;第10頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四9.在溶解DNA中加入3-5μlRNase，37℃消化2-3h；10.補充ddH2O至總體積400μl

，加入等體積的酚/氯仿，混勻；11.12000rpm，5min（RT），12.取上清，加入1/10體積的乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇，-20℃放置10min;13.12000rpm，4℃離心10min；14.去上清，70%乙醇洗滌沉淀,12000rpm，4℃離心5min;15.去上清，沉淀干燥后，加入20μlddH2O溶解DNA；16.分光光度計法檢測DNA的濃度和純度。第11頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四實驗報告分析A260=1時相當于50μg的雙鏈DNA。A260/A280=1.8，DNA純度高。A260/A280<1.7，有蛋白質的污染。A260/A280>1.9,有RNA的污染或者降解。A260/A230在2.0—2.5，DNA純度高。A260/A230<2.0,有糖類，鹽類或者有機溶劑污染。第12頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四注意事項（1）選用幼嫩植物組織，可減少淀粉類的含量。（2）植物組織充分勻漿。（3）DNA的二級結構和雙鏈易受多種因素的影響引起雙鏈解開，即“變性”，因此抽提時避免使用變性的條件。（4）抑制內外源DNase的活力。（5）防止化學降解。（6）防止物理因素降解。。第13頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四思考題.1在擬南芥基因組提取緩沖液中，EDTA和SDS的作用分別是什么？第14頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四實驗二PCR克隆目的基因

一實驗原理

PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶鏈式反應)是一種選擇性體外擴增DNA的方法.它包括三個基本步驟:(1)變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈;(2)退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(56℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板進行合成.

由這三個基本步驟組成一輪循環,理論上每一輪循環將使目的DNA擴增一倍,這些經合成產生的DNA又可作為下一輪循環的模板,所以經25-35輪循環就可使DNA擴增達待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。第15頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四PCR原理FLASH演示第16頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四PCR技術發展

PCR是20世紀80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。

它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍。

PCR技術是生物科學領域中的一項革命性創舉和里程碑。第17頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。

Mullis因發明了“聚合酶鏈式反應”而獲得1993年度諾貝爾化學。

第18頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。

Klenow這些缺點給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視。第19頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四

TaqDNAPolymerase1988年Saiki等從水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取耐高溫的TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)，此酶在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%。

缺點：

TaqDNAPolymerase只有5’→3’聚合酶活性，但沒有3’→5’外切活性，無法消除突變和錯配，堿基錯誤摻入率可達10-4/堿基/循環第20頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四PfuDNAPolymerase

PfuDNA

聚合酶是已知保真度最高的聚合酶，來自于Pyrococcusfuriosis菌株，不僅具有摻入反應迅速及熱穩定性高的優點，更是當前市場上所有DNA聚合酶中摻入出錯率最低的一種。優點：Pfu具有3’→5’校閱功能，其錯配率分別僅為10-7。缺點：效率低，擴增片段較短第21頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四TaqPlusDNAPolymerase

是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物，與TaqDNA聚合酶相比，具有擴增長度增加（簡單模板可有效擴增20kb,復雜模板可有效擴增10kb),保真度好的特點；與PfuDNA聚合酶相比，具有擴增速度快，反應效率高的優勢。第22頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四PCR反應體系組成模板5’引物和3’引物4種dNTPDNA聚合酶Mg2+反應緩沖液第23頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四1.模板PCR反應必須以DNA為模板進行擴增,模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環狀分子就模板DNA而言,影響PCR的主要因素:

純度:蛋白、多糖、酚類等雜質會抑制PCR反應完整性:模板降解會導致PCR擴增無產物濃度:加量過多導致非特異性擴增增加第24頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四2.引物PCR反應產物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關鍵引物影響因素：特異性：長度適當、避免二級結構和二聚體完整性：避免反復凍融濃度：應適當,過高導致非特異性增加,過低則擴增產物太少第25頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四引物設計原則(1)引物長度：約為16-30b(2)G+C含量：G+C含量通常為40%-60%,較短引物可粗略估計Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3)四種堿基隨機分布，在3‘端不存在連續3個G或C,因這樣易導致錯誤引發。(4)在引物內及兩引物之間,尤其在3‘端應不存在二級結構。(5)引物5‘端對擴增特異性影響不大,可在引物設計時加上限制酶位點。(6)引物不與模板結合位點以外的序列互補第26頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四4種dNTP

濃度適當，避免反復凍融dNTP原液配成10mM或者2.5mM分裝,-20oC貯存。一般反應中每種dNTP的終濃度為20-200μM。當dNTP終濃度大于50mM時可抑制TaqDNA聚合酶的活性.4種dNTP的濃度應該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現的錯誤摻入。第27頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四Mg2+

過高非特異性嚴重，過低無擴增產物Mg2+濃度對DNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性,影響引物退火和解鏈溫度,影響產物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+濃度范圍為0.5-3mM。試劑公司通常會將Mg2+加入到DNA聚合酶的反應緩沖液中：

10×ReactionBuffer(includingMg2+)10×ReactionBuffer(withoutMg2+)第28頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四DNA聚合酶TaqDNAPolymerase活性半衰期為95℃40min,97℃5min.TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,30min,摻入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率,一般PCR中出錯率為2×10-4

核苷酸/每輪循環,100μlPCR反應中,1.5-2單位的TaqDNA聚合酶就足以進行30輪循環.反應結束后，如果需要利用這些產物進行下一步實驗,需要預先滅活TaqDNA聚合酶,滅活TaqDNA聚合酶的方法有：(1)PCR產物經酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。(2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。(3)99-100℃加熱10min.目前已有直接純化PCR產物的Kit可用。Taq/Pfu/TaqPlusDNAPolymerase第29頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四DNA聚合酶單位定義：1個酶單位是指在以下分析條件下，于74℃，30min內使10nmol/L的dNTP摻入核酸中所需的酶。不同公司提供的酶U的定義也不同。第30頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四反應緩沖液各種DNA聚合酶都有自己特定反應緩沖液；TaqDNAPolymerase反應緩沖液一般含：

10-50mMTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)50mMKCl

適當濃度的Mg2+第31頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四緩沖液10mmol/lTris.Cl提供適合反應的pH值（pH8.4）50mmol/lKCl促進引物退火10μg/ml明膠或血清白蛋白為Taq酶的保護劑第32頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四PCR反應主要參數：1.預變性：94°C，3--5min2.變性：94°C，30s-1min3.復性：56°C，20s--2min4.延伸：72°C，30s--3min5.總延伸：72°C，10min第33頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四預變性和變性在第一輪循環前,在94℃下變性3－5min非常重要,它可使模板DNA完全解鏈。變性不完全,往往使PCR失敗,因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復性,減少DNA產量.一般變性溫度與時間為94℃1min。在變性溫度下,雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時間主要是為使反應體系完全達到適當的溫度。第34頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四退火引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度.實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值約低5℃。通常退火溫度和時間為55℃左右,1-2min。第35頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四延伸延伸反應通常為72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最適反應溫度75℃.實際上。延伸反應時間的長短取決于目的序列的長度和濃度。TaqDNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長的DNA。一般在擴增反應完成后,都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應,以獲得盡可能完整的產物,這對以后進行克隆或測序反應尤為重要。第36頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四循環次數循環次數主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環已經足夠。循環次數過多,會使PCR產物中非特異性產物大量增加。第37頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四1.通過PCR從擬南芥基因組中擴增目的基因片段2.學習PCR儀等儀器的使用實驗目的第38頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四材料：擬南芥基因組DNA器材：移液器及吸頭，PCR管，PCR儀，臺式離心機。實驗材料和器材第39頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四所需試劑10×PCR反應緩沖液dNTPMix:每種10mM5’和3’引物：各10pmol/μl（10μmmol/L）TaqDNA聚合酶5U/μl無菌去離子水；第40頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四實驗步驟1.在PCR管中依次混勻下列試劑(總體積50μl)5μl10×Buffer(IncludingMgCl2)1μldNTPmix（各10mM）1μl5’上游引物（10μM）1μl3’下游引物（10μM）模板DNA(1000ng)0.25μlTaqDNA聚合酶補充ddH2O至50μl

混勻后短暫離心（點離）。第41頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四2.將PCR管放置到PCR儀中，蓋好蓋子3.用94oC預變性3-5分鐘；94oC變性1分鐘，58oC退火1分鐘,72oC延伸2分鐘,30個循環；最后一輪循環結束后,于72oC下保溫10分鐘，4.終止反應，從PCR儀取出PCR管，放置4oC存第42頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四1.PCR非常靈敏,盡可能避免污染。吸頭、離心管應高壓滅菌,每次吸頭用畢應更換,不要互相污染試劑；

2.加試劑前,應短促離心10秒鐘,然后再打開管蓋,以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側面；

3.應設含除模板DNA所有其它成分的負對照。注意事項第43頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四思考題簡述PCR技術克隆的主要原理。第44頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四實驗三PCR產物瓊脂糖凝膠電泳第45頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四一、實驗原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同DNA的分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區帶第46頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四影響DNA遷移速率因素DNA分子泳動主要的因素分兩方面：DNA分子特性和電泳條件。1.DNA的分子大小:2.DNA分子的構象3.瓊脂糖濃度4.電源電壓5.嵌入染料的存在6.離子強度影響第47頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四

瓊脂糖是從瓊脂中分離得到，由1,3連接的吡喃型b-D-半乳糖和1,4連接的3,6脫水吡喃型阿a-L-半乳糖組成，形成相對分子量為104～105的長鏈。

瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機線團狀分布，當溫度降低時鏈間糖分子上的羥基通過氫鍵作用相連接，形成孔徑結構，而隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑

第48頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍第49頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四核酸電泳緩沖液有三種Tris-乙酸(TAE)、Tris-硼酸(TBE)和Tris-磷酸(TPE).

第50頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四DNA電泳上樣緩沖液

DNALoadingBuffer作用

1.螯合Mg2＋，防止電泳過程中DNA被降解，一般上樣緩沖液中含10mMEDTA。

2.增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。

3.指示劑監測電泳的行進過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍指示電泳的前沿，它的速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同。第51頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四DNA電泳的標準分子量

目前各廠商開發了各種類型的標準分子量，有廣泛用于PCR產物鑒定的小分子Marker，也有常規用的大分子Marker常用的DNA標準分子量電泳圖第52頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四二、實驗目的

1掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法2通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增的目的基因第53頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四儀器及耗材：天平、電泳設備、臺式離心機、稱量紙、藥勺、微量移液器及吸頭、EP管、封口膜、三角瓶、微波爐、凝膠成像系統。材料：PCR產物試劑：瓊脂糖，1×TAE電泳緩沖液、溴化乙錠（EB）、6×Loadingbuffer、無菌去離子水、DNAMarker；三、實驗儀器、材料和試劑第54頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四四、實驗步驟1.1g瓊脂糖加入100ml0.5×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。2.將制膠板放好，插入適當梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固3.充分凝固后將膠板取出，小心垂直向上拔出梳子，置入電泳槽中，加0.5×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm。第55頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四第56頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四4.用移液器吸取3μl的6×loadingbuffer于封口膜上，再加入5μlDNA樣品，混勻后，小心加入點樣孔。5.打開電源開關，一般紅色為正極黑色為負極，調節電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，電泳約30min-60min。6.在瓷盤中加入適量的水，再加入5－10μlEB，將凝膠放入盤中5－10分鐘

7.將凝膠置于凝膠成像儀內，再紫外燈下檢測PCR產物的DNA條帶第57頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四第58頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四思考題瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素影響？第59頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四實驗四目的基因與載體連接第60頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四一、實驗原理第61頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四目的基因與載體連接平末端連接粘性末端連接T載體策略連接第62頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四平末端連接TaqDNA聚合酶往往在PCR產物3'端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR產物前,可用Klenow片段或T4DNA聚合酶處理補平末端。有些DNA聚合酶（pfuDNA聚合酶）擴增的PCR產物為平端，可以直接用于平端連接第63頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四粘性末端連接利用引物中附加在5'端的限制酶位點,直接將PCR產物經適當的限制酶切割后產生粘性末端,與載體連接,產生重組DNA.如果下游兩個引物中含有兩個不同的限制酶位點.經酶切后定向克隆到載體中。第64頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四T-載體連接TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3‘末端加一個非模板依賴堿基(A或T),所加堿基多為A。利用這一特點,可以經限制酶(如EcoRV)切割載體,使其產生平末端,再利用TaqDNA聚合酶向載體雙鏈DNA的3‘末端加上T,使載體與PCR產物末端互補并進行連接第65頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四pMD18-TVectorpMD18-TVector是一種高效克隆PCR產物（TACloning）的專用載體。用EcoRV進行酶切反應后，再在兩側的3‘端添加“T”而成。，本制品中的高效連接液SolutionI可以在短時間內（約30分鐘）完成連接反應，大大方便了實驗操作。第66頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四pMD18-TVector的結構第67頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四二、實驗目的

1.通過T載體策略進行目的基因與載體的連接第68頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四儀器及耗材：臺式離心機、微量移液器及吸頭、EP管、封口膜、水浴鍋。材料：PCR產物試劑：無菌去離子水；pMD18-T

三、實驗儀器、材料和試劑第69頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四四、實驗步驟1.將PCR產物移入1.5mLEP管中，加去離子水至400μl，加入1/10倍體積的3MNaAc和2.5倍體積的無水乙醇，混勻，-20℃放置10min；2.12000rpm，4℃，離心10min；3.去上清，將EP管倒置于吸水紙上；4.向EP管加入適量70%乙醇，將DNA沉淀重懸；5.12000rpm，4℃，離心5min；6.去上清，倒置吸水紙上，晾干，加入20μl去離子水溶解DNA。第70頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四7.測定DNA的濃度；8.沉淀的目的基因DNA與T載體連接：取一新的PCR管，加入下列反應成分(總體積10μl)

：

目的DNA4.5μl(0.1pmol～0.3pmol)pMD18-TVector0.5μl

加入5μl（等量）的SolutionI；9.16OC水浴中反應30分鐘。10.將連接產物-20℃保存。第71頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四思考題簡述目的DNA片段與載體連接的不同策略。第72頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四實驗五大腸桿菌感受態細胞制備第73頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四一實驗原理

在自然條件下,很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內,但在人工構建的質粒載體中,一般缺乏此種轉移所必需的mob基因,因此不能憑自己的能力進入細菌。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態以攝取外源DNA。細菌處于容易吸收外源DNA的狀態叫感受態。第74頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四感受態細胞制備方法化學法:CaCl2

處理后細胞膜的通透性發生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞;物理法:

大腸桿菌暴露在電荷中時，其細胞膜會不穩定而誘導形成孔洞，于是DNA分子可由該孔進入細胞。第75頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四感受態細胞制備中應注意因素細胞生長狀態和密度不要用經過多次轉接或儲于４℃的培養菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監測培養液的OD600

來控制。DH5α菌株的OD600

為0.5時,細胞密度在5×107個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。2.試劑的質量所用的試劑,如CaCl2

等均需較高純度，冰箱保存。3.防止雜菌和雜DNA的污染整個操作過程均應在無菌條件下進行,所用器皿,如離心管,tip頭等最好是新的,并經高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染。第76頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四二實驗目的1.學習以E.coliDH5α菌株為受體細胞，用CaCl2處理受體菌使其處于為感受態；2.制備大腸桿菌感受態細胞，為轉化實驗作準備。第77頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四儀器及耗材：培養皿、細菌投布器、三角瓶、牙簽、恒溫搖床、電熱恒溫培養箱、分光光度計、冷凍離心機、50mL離心管、無菌工作臺材料：E.coliDH5α菌株試劑：LB固體和液體培養基、100mMCaCl2、甘油。三、實驗儀器、材料和試劑第78頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四LB液體培養基(Luria-Bertani)配方：

蛋白胨(Tryptone)1g

酵母提取物(Yeastextract)0.5gNaCl1g

加去離子水至總體積100mL，用NaOH調pH至7.0,高壓滅菌LB固體培養基配方：每100mLLB液體培養基中加1.2g瓊脂粉,高壓滅菌。第79頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四超凈工作臺第80頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四離心設備臺式高速冷凍離心機第81頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四恒溫空氣搖床第82頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四恒溫培養箱培養皿第83頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四四實驗步驟

菌株活化1．用接種環直接取凍存的大腸桿菌DH5α，在LB培養基平板表面劃線，于37℃培養16小時；2．挑取一個單菌落，轉到10mlLB培養基中，于37℃培養3－5小時；3．將培養液全部轉到100mlLB培養基中培養2－3小時，到OD600＝0.45-0.55第84頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四感受態細胞制備4.將30ml菌液轉入離心管中，冰上10min;5.4oC，5,000rpm，離心5min；第85頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四6.去上清，將沉淀重懸于10ml用冰預冷的100mMCaCl2中，置于冰上30min；7.4oC，5,000rpm，離心5min；8.去上清，將沉淀重懸于1mL用冰預冷的100mMCaCl2溶液中，再加入75%甘油至終濃度為15-20%(0.4ml),混勻；9.按每管100l分裝，冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞，-70oC冰箱中保存.第86頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四注意事項不要用經過多次轉接或放于4℃的培養菌，最好直接從甘油保存的菌種中直接轉接。第87頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四思考題感受態細胞有什么特點？簡述感受態細胞制備的原理第88頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四實驗六連接產物轉化大腸桿菌第89頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四一實驗原理

轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。第90頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四

大腸桿菌感受態細胞與重組質粒DNA放置在冰浴(0oC)，CaCl2低滲溶液中，細菌細胞膨脹成球形。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基—鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經突然熱激（42oC）處理，更有利于細胞對DNA復合物的攝取，外源DNA分子通過吸附、轉入、自穩而進入細胞內，并且開始進行復制和表達。第91頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四

將細菌放置在非選擇性培養基中保溫一段時間，促使在轉化過程中獲得的新的表型(如Ampr等)得到表達，然后將此細菌培養物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養基上。第92頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四ＤＮＡ分子轉化分以下幾步:１．吸附－－雙鏈ＤＮＡ分子吸附于受體菌表面；２．轉入－－雙鏈ＤＮＡ分子解鏈。一條鏈進入受體菌，另一條降解；３．自穩－－外源質粒ＤＮＡ分子在細胞內復制成雙鏈；４．表達一供體基因隨同復制子同時復制，分裂，轉錄翻譯。第93頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四二實驗目的

將目的基因與質粒的連接產物轉入大腸桿菌（DH5α）感受態細胞，為重組載體的篩選最準備第94頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四儀器及耗材：培養皿、細菌投布器、三角瓶、恒溫搖床、電熱恒溫培養箱、水浴鍋、無菌工作臺材料：目的基因與載體的連接產物；大腸桿菌感受態細胞試劑：

LB固體和液體培養基、氨芐青霉素(100mg/mL)、IPTG(200mg/mL)、X-gal(20mg/mL),。三、實驗儀器、材料和試劑第95頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四氨芐青霉素(Amp)配置：無菌水配制氨芐青霉素成100mg/mL溶液，過濾除菌，-20oC冰箱保存；X-gal配置：將X-gal溶于二甲基甲酰胺中，配成20mg/mL濃度的溶液，裝于玻璃或聚丙烯管中，以錫鉑紙包裹避光保存于-20oC，X-gal不需要過濾除菌；IPTG配置：將2gIPTG溶于8mL水中，用水調節體積到10mL,過濾除菌，-20oC冰箱保存。第96頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四固體LB平板的準備1.固體LB培養基的配置：每100mL液體LB培養基加入1.2g瓊脂粉，pH7.0，高溫滅菌；2.固體LB培養基融化后，冷卻到50oC，加入氨芐青霉素（100μg/mL），再倒入滅菌的平板內；3.在LB固體培養基表面均勻投布4μLIPTG(200mg/mL)和40μLx-gal(20mg/mL),吹干;四實驗步驟第97頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四4.從-70oC冰箱中取出感受態細胞,置冰上解凍；5.在超凈臺上，取5l連接產物加入到感受態細胞中，充分混勻，冰上放置30min；6.42oC熱激處理90sec，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘；7.加入600－800l無抗生素的LB液體培養基，37oC，50－60rpm溫育45min，使細菌恢復正常生長狀態,并表達質粒編碼的抗生素抗性基因；8.菌液均勻涂布到含有抗生素（Amp100g/ml,并均勻的涂布有IPTG和X-gal）的LB平板上吹干，將培養皿倒置于37oC，培養16h；第98頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四思考題觀察實驗結果，你的平板上出現單菌落沒有？分析總結一下影響轉化效率的因素。第99頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四實驗七陽性克隆的鑒定和篩選第100頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四

將目的基因與載體進行連接形成重組子并轉化后，在連接產物中既有載體和目的基因的連接，也有載體的自連和目的基因的自連，更多的是未發生連接反應的載體和目的DNA片斷。這就需要我們對陽性克隆進行鑒定和篩選，將含有外源DNA的宿主細胞和不含外源DNA的宿主細胞分開，將含有正確重組子的宿主細胞和含有其他外源DNA的宿主細胞分開。一實驗原理第101頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四

在我們的實驗中，目的基因與T載體(pMD18-T)連接產物,轉化E.coliDH5α菌株。由于pMD18-T上帶有Ampr

和lacZ基因,故重組子的篩選首先采用Amp抗性篩選與α-互補現象篩選相結合的方法。第102頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四pMD18-TVector的結構第103頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四

因pMD18-T帶有Ampr

基因而外源片段上不帶該基因,故轉化受體菌后只有帶有pMD18-TDNA的轉化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來（質粒自身環化和重組載體）;而只帶有自身環化的外源片段的轉化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。第104頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四α-互補

pMD18-T上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區中插入了一個多克隆位點,但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。E.coliDH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情況下,pMD18-T和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。當這種載體轉入可編碼－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞中時，在異丙基--D硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導下，宿主可同時合成這兩種肽段，雖然它們各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質。所以稱這種現象為-互補現象。第105頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四

由互補產生的－半乳糖苷酶(LacZ)能夠作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－－D－半乳糖苷(X-gal)而產生藍色的菌落，所以利用這個特點，在載體的該基因編碼序列之間人工放入一個多克隆位點，當插入一個外源DNA片段時，會造成LacZ()基因的失活，破壞-互補作用，就不能產生具有活性的酶。所以，有重組質粒的菌落為白色，而沒有重組質粒的菌落為藍色。第106頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四第107頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四重組DNA轉化細菌過程示意圖第108頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四菌落PCR鑒定陽性克隆

并不是所有白斑菌落是含有重組質粒的陽性菌落，存在假陽性現象。可以通過菌落PCR進一步鑒定含有重組質粒的陽性菌落。第109頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四常規的PCR鑒定需要進行細菌培養、質粒提取等多步操作后才能進行基因擴增，操作繁瑣，耗時較長，為了簡化操作程序，Gussow和Clackon提出菌落PCR方法，即用無菌牙簽挑取單菌落到TE緩沖液中，煮沸5min，渦旋振蕩后短暫離心，用1－2μL裂解液作DNA模板，這樣就省去了抽提模板DNA這一步，大大節省了時間和成本。后來該方法進一步改進，利用牙簽直接沾取一點單菌落作為模板進行擴增反應更大量節省了時間，簡化了操作程序，單菌落PCR可以有效的篩選陽性重組克隆。第110頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四二實驗目的1.學習通過藍白斑篩選陽性重組菌落；2.學習菌落PCR技術及通過菌落PCR鑒定白斑菌落。第111頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四儀器及耗材：培養皿、電熱恒溫培養箱、無菌工作臺、牙簽、PCR管、各種tip、PCR儀。材料：連接產物轉化后的菌落平板三、實驗儀器、材料和試劑第112頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四試劑：LB液體培養基氨芐青霉素(100mg/mL)

10×PCR反應緩沖液;dNTPMix(每種2.5mM);5’和3’引物（10μmM）;TaqDNA聚合酶2.5U/μl;無菌去離子水；第113頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四1.建立PCR體系(總體積20μl)

可以以小組為單位，現將上述各試劑混合，再分裝，如小組為4人，就在EP管中加入4倍體積的上述各組分（除菌液），在分裝到PCR管，這樣便于試劑取樣。

ddH2O16.482μl10×Buffer(IncludingMgCl2)2.010μldNTPmix（各10mM）0.42μl5’上游引物（10μM）0.42μl3’下游引物（10μM）0.42μlTaqDNA聚合酶0.42μl2.用牙簽從LB固體平板上挑取白斑單菌落在PCR管中攪拌。四實驗步驟第114頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四3.將PCR管放置到PCR儀中，蓋好蓋子；4.用94oC預變性3-5分鐘；94oC變性1分鐘，58oC退火1分鐘,72oC延伸2分鐘,32個循環；最后一輪循環結束后,于72oC下保溫10分鐘；5.終止反應，從PCR儀取出PCR管，放置4oC存。第115頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四五注意事項1.X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶水解后生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷為非生理性的誘導物，它可以誘導lacZ的表達。3.在含有X-gal、IPTG的篩選培養基上，攜帶載體DNA的轉化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落，平板如在37℃培養后放于冰箱3-4小時可使顯色反應充分，藍色菌落明顯。第116頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四思考題簡述利用藍白斑篩選重組子的原理第117頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四實驗八重組質粒的提取第118頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四一、實驗原理

從細菌中分離質粒DNA方法包括3個基本步驟:1.培養細菌使質粒擴增；

2.收集和裂解細胞;3.分離和純化質粒DNA。第119頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四1.細菌培養質粒的擴增與質粒在細菌細胞內的拷貝數和細菌個數正相關。質?？截悢凳侵冈谡ＩL條件下，每個細菌細胞所對應的平均質粒數。在質粒復制子調控下，質粒拷貝數可隨細菌培養條件變化而在較窄的范圍波動，生長條件恒定，質粒增殖速度與宿主細胞增殖速度完全一致，拷貝數保持不變。第120頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四2.細菌的收獲與裂解細菌的收獲可以通過離心來進行；細菌的裂解可以采用多種方法，這些方法包括非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及加熱處理等。采用何種方法取決于三個因素：質粒的大小、大腸桿菌菌株和裂解后用于純化質粒DNA技術。第121頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四大質粒（＞15kb）采用溫和方法小質粒（＜15kb）可采用較劇烈方法有些大腸桿菌菌株不能采用加熱的方法裂解；第122頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四3.分離和純化質粒DNA

當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA變性,而共價閉合環狀DNA的兩條鏈不會相互分開，當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA片段難以復性,而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起,而質粒DNA雙鏈又恢復原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態存在于液相中。第123頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四

在細菌細胞內,共價閉環質粒以超螺旋形式存在。在提取質粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會產生其它形式的質粒DNA。如果質粒DNA兩條鏈中有一條鏈發生一處或多處斷裂,分子就能旋轉而消除鏈的張力,形成松馳型的環狀分子,稱開環DNA；如果質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA。當提取的質粒DNA電泳時,同一質粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環和線狀分子的泳動速度快。第124頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四二、實驗目的

1了解質粒各種提取方法2通過堿法提取重組質粒第125頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四儀器及耗材：三角瓶、超凈工作臺、臺式離心機、微量移液器及吸頭、EP管、DNA振蕩器。材料：含有重組質粒的培養細菌三、實驗儀器、材料和試劑第126頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四

堿法提取質粒需要的試劑：溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ配制后高壓滅菌15分鐘,儲存于4℃冰箱。溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1％SDS(臨用前用10mol/LNaOH和10％SDS現配)。溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml,并高壓滅菌。試劑第127頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四（一）、堿法1.

接種少許通過PCR鑒定含有重組質粒DH5α菌液到液體LB培養基(含100μg/mlAmp)中,37℃振蕩培養約12小時至對數生長后期；。2、取菌液入1.5mlEP管中,4℃，8,000rpm,5min;3、棄上清,將管倒置于吸水紙上數分鐘,使液體流盡；4、菌體沉淀重懸浮于200μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩)；5、加入新配制的溶液Ⅱ400μl,接近水平旋轉EP管,以混勻內容物(不要振蕩),冰浴5分鐘。6、加入300μl預冷的溶液Ⅲ,溫和轉動EP管至絮狀沉淀出現，冰浴中5-10分鐘,4℃，12,000rpm,10min;四、實驗步驟第128頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四7.上清液移入干凈EP管中,加0.8倍體積5MLiCl,混勻,-20℃,20min;8.4℃,12,000rpm，10min9.將水相移入干凈EP管中,加入0.8倍體積的異丙醇,振蕩混勻后，室溫放置5分鐘，然后4℃,12,000rpm，10min；10.棄上清,將管口敞開倒置于吸水紙上使所有液體流出,加入70％乙醇洗沉淀一次,4℃,12,000rpm，5min；11.吸除上清液,將管倒置于吸水紙上使液體流盡,室溫干燥。12.將沉淀溶于20μlddH2O中,加入1-2μlRNaseA,37℃水浴中溫育2-3h.第129頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四思考題質粒提取實驗中，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ各起什么作用？第130頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四實驗九重組質粒酶切分析第131頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四一、實驗原理

限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。限制性內切酶可分為三類:

Ⅰ類和III酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA；III類酶在識別位點上切割DNA分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成:一種為限制性內切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列;另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。第132頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四

分子克隆中廣泛應用的是：Ⅱ類中的限制性內切酶。絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5‘-G↓AATTC-3’),有少數酶識別更長的序列或簡并序列。

Ⅱ類酶切割位點在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’);有的切割位點在對稱軸一側,產生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端,如EcoRⅠ切割識別序列后產生兩個互補的粘性末端（5’-G↓AATTC-3’）。第133頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四BamHI第134頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四pET32a多克隆位點上也有BamHI位點第135頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四克隆基因引物也加入了BamHI位點Primer5’:GGATCCATGGCGGAGAAAATCACGPrimer3’:GGATCCCTATTCAGTGTCAGACGGCAAG第136頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四影響酶切反應的因素

1.DNA純度

2.緩沖液

3.溫度條件

4.甘油含量第137頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四Takara公司提供的不同緩沖液BamHI第138頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四溫度：37OC（BamHI30OC）甘油：控制在10％以下第139頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四二、實驗目的

1掌握限制性內切酶酶切反應原理和方法；2將上一實驗獲得的重組質粒及表達載體pET進行限制性內切酶消化（注：不需要酶切pET質粒，老師已經為大家切好了）

第140頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四儀器及耗材：臺式離心機、微量移液器及吸頭、EP管、恒溫水浴鍋。材料：重組質粒和載體質粒三、實驗儀器、材料和試劑第141頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四

內切酶：BamHI

內切酶緩沖液:10*BufferKddH2O

試劑第142頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四推薦一般反應體系四、實驗步驟第143頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四1.重組質粒單酶切酶切反應體系如下(20μl

)：10*BufferK2μl質粒DNA10μlBamHI1μl補充ddH2O到總體積20μl2.將上述反應體系混勻后，短暫離心，于37OC反應2-3小時第144頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四思考題限制性核酸內切酶有什么特點？第145頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四實驗十電泳分析酶切反應

第146頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四一、實驗原理1.瓊脂糖凝膠電泳原理同實驗二第147頁，共166頁，2023年，2月20日，星期四1.DNAMarker2.重組質粒pMD18-Gene酶