免疫原和抗體的制備第1頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三概要第一代抗體：多克隆抗體第二代抗體：單克隆抗體第三代抗體：基因工程抗體第2頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三第一部分多克隆抗體制備英文全稱：polyclonalantibody,PcAb定義：它是由多種抗原決定簇刺激多株B細胞增殖分化所產生的抗體，是多種抗體的混合物。如何制備？是通過給動物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清。第3頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三人體BBBBAgAgAgAg免疫血清制備機制人體第4頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三免疫原(及佐劑)的制備免疫動物試血抗血清的保存抗血清的鑒定采血收集血清抗血清的純化第5頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三一、免疫原的制備免疫原(immunogen)是能誘導機體產生抗體并能與抗體發生反應的物質一)顆粒性抗原的制備二)可溶性抗原制備及鑒定三)半抗原免疫原的制備第6頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三細胞抗原：綿羊紅細胞細菌抗原：菌體抗原、鞭毛抗原寄生蟲體抗原：蟲卵一）顆粒性抗原的制備特點：制作方法較為簡單；懸液呈渾濁狀或乳濁狀；免疫時多用靜脈注射，不需佐劑第7頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三

綿羊紅細胞的制備流程圖搖動15-20min

4℃可保存3周取適量NS洗滌3次2000r/min10minNS稀釋至2～5%第8頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三

細菌菌體抗原的制備流程圖液體培養或斜面培養37℃24h100℃水浴2～2.5h

殺菌無菌試驗NS稀釋成8～10億/mlO菌體抗原第9頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三來源:

組織、細胞或血液，其成分較復雜。

二、可溶性抗原制備及鑒定可溶性抗原:蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、酶類、補體、脂多糖、細菌外毒素和核酸二）可溶性抗原制備及鑒定第10頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三制備流程：細胞的破碎抗原的分離及純化器官組織：組織細胞：血液：抗原的鑒定組織碎塊預處理返回第11頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三1、組織材料的預處理組織必須是新鮮或低溫保存的去除包膜或結締組織臟器進行灌洗洗去血跡及污物NS內含0.5g／LNaN3冷浴中組織剪碎組織碎塊第12頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三1)高速搗碎法2)研磨法3)超聲破碎法4)反復凍融法5)酶處理法6)表面活性劑處理2、細胞破碎技術及評價物理法化學法第13頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三上清液澄清組織碎塊裝入搗碎機簡內高速粉碎制成組織勻漿液2000r／min取上清液去除細胞碎片及微小組織離心特點：①操作簡單，無需貴重儀器；②多用于內臟組織的破碎。1)高速搗碎法1000r／min15000r／min第14頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三原理：利用超聲波的機械振動產生的壓力足以使細胞破碎。方法：使用的頻率從1kHz～20kHz不等的超聲波處理細胞，間歇進行，避免長期超聲產熱，導致抗原破壞。2)超聲破碎法特點：①操作簡單，重復性較好，節省時間；②多用于組織細胞和細菌的破碎。第15頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三

2.凍融法原理：因速凍緩融，細胞內冰晶的形成及胞內外溶劑濃度突然改變而破壞細胞。3)反復凍融法方法：將待破碎的細胞置-20℃冰箱內凍結，然后室溫融化，如此反復3-4次，大部分組織細胞及細胞內的顆粒可被融破。特點：此法適用于組織細胞，對微生物細胞作用較差。第16頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三

常用酶類：溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等

1.酶處理法4)酶處理法方法：在一定的條件下，能消化細菌和組織細胞。

特點：①此法適用多種微生物；②具有作用條件溫和；③內含物成分不易受到破壞；④細胞壁損壞的程度可以控制。第17頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三原理：在適當的溫度、pH及低離子強度的條件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，使膜的滲透性改變或使之溶解。5)表面活性劑處理常用的有：十二烷基硫酸鈉(SDS,陰離子型)、二乙胺十六烷基溴（陽離子型）、聚山梨酯（非離子型）、新潔爾滅等。應用：①破碎細菌，且作用比較溫和；②提取核酸時，常用此法破碎細胞。返回第18頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三3、蛋白質抗原的提取與純化蛋白質親和層析離子交換層析凝膠過濾鹽析沉淀超速離心分離法蛋白質、多糖、脂類、核酸第19頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三

1)．超速離心法

原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度的梯度層內，達到彼此分離的目的。

1)超速離心法特點：用差速離心或梯度密度離心法純化抗原，極難將某一抗原成分分離出來。

應用：用于少部分大分子抗原IgM、C1q、甲狀腺球蛋白、載脂蛋白A、B等。不適于中、小分子量蛋白質。轉速大于20000r/min第20頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三2)鹽析法方法：用50、33%的硫酸銨分次提取，即可獲得丙種球蛋白(含IgG95%以上)。特點：簡單方便，純度不高，粗提球蛋白。應用：在大量制備中先用此法粗提，再純化。原理：白蛋白可溶于半飽和的硫酸銨溶液中，而球蛋白則沉淀析出；該達到飽和時，白蛋白也析出，因此不同飽和度的硫酸銨或硫酸鈉，可將白蛋白和球蛋白分離。第21頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三

3．凝膠層析法（凝膠過濾法）原理：利用凝膠的多孔網狀結構，大分子在凝膠顆粒間很快通過，小分子進入網孔，難于洗脫，將抗原分為大、中、小三種。屬區帶分離法。3)凝膠層析法（凝膠過濾法）特點：是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。

第22頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三

原理：利用帶離子基團的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質抗原。各種蛋白質的等電點不同，所帶電荷不同，與纖維素結合的能力有差別。當梯度洗脫時，逐步增加流動相的離子強度，使加入的離子與蛋白質競爭纖維素上的電荷位置，從而使血清中的蛋白質分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等幾個部分而被洗脫下來，達到分離純化的目的。4)離子交換層析法第23頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三5)親和層析法（蛋白A純化IgG）蛋白A瓊脂糖上樣靜置30分鐘注：上樣速度慢第24頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三優點：純度高、獲得物不失活性，簡便快捷。返回結合緩沖液沖洗洗脫緩沖液沖洗第25頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三純化抗原的鑒定1).含量鑒定

2).理化性質鑒定①凝膠層析技術測定

②聚丙烯酰胺凝膠電泳

③凝膠管狀電泳

④超速離心3).純度鑒定

常用醋酸纖維膜電泳

4).免疫活性鑒定

常用雙向瓊脂擴散試驗4、純化抗原的鑒定返回第26頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三

四、佐劑英文全稱：immunoadjuvant概念：

與抗原同時或預先注射于機體，能增加機體免疫應答或改變免疫應答類型的物質。

二、免疫佐劑第27頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三化合物:氫氧化鋁、明礬、礦物油、吐溫-80、弗氏不完全佐劑以及人工合成的多聚肌苷酸∶胞苷酸(polyI∶C)、脂質體生物制劑:處理改造的細菌及代謝產物，如卡介苗、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌及CTB、LPS和類脂A、胞壁酰二肽等；細胞因子及熱休克蛋白一)佐劑的種類第28頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三用于人體的佐劑：氫氧化鋁、明礬、polyI∶C、胞壁酰二肽、細胞因子、熱休克蛋白常用于動物實驗的佐劑：弗氏佐劑(Freund’sadjuvant)

一)佐劑的種類第29頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三1.氫氧化鋁佐劑：5%硫酸鋁5%氫氧化鈉氫氧化鋁沉淀制成懸液即為佐劑強烈攪拌NS洗二次NS等體積抗原免疫接種（二）常見佐劑第30頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三2.明礬佐劑10%硫酸鉀鋁氫氧化鈉校正pH值至6.5沉淀乳狀懸液*明礬佐劑抗原常用用于肌肉注射，皮下注射易引起肉芽種和膿腫。NS攪拌NS洗二次離心抗原備用防腐劑第31頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三混合1~5:1作用大于不完全佐劑;局部形成肉芽種和潰瘍;不能用于人體弗氏完全佐劑3.弗氏佐劑(Freundadjuvant)液體石蠟＋弗氏不完全佐劑卡介苗終濃度2～20mg/ml羊毛脂抗原抗原1:11:1完全乳化鑒定一滴乳劑乳劑不散浮于液面水中第32頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三乳化方式：研磨法：

易乳化，但抗原或佐劑用量大。攪拌混合法：

無菌操作，節省抗原或佐劑，但不易乳化完全。第33頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三4.脂質體其與抗原合用，可更有效地激發機體的免疫功能，增強免疫反應。IL－2、IL－1、IFN等都是良好的佐劑。包封抗原后，可使抗原延緩釋放，并且脂質體有刺激機體免疫反應的作用。5.細胞因子第34頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三1.改變抗原的物理性狀，使抗原在體內滯留或延緩釋放，延長抗原與免疫細胞作用的時間，從而增強抗原免疫原性。2.抗原在佐劑的輔助作用下，更易被巨噬細胞有效吞噬和有效的加工處理和呈遞。3.刺激單核－巨噬細胞活化，釋放細胞因子調節和增強淋巴細胞的應答能力。4.刺激淋巴細胞增生分化，從而增強和擴大免疫應答能力。（三）作用機制第35頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三應用佐劑的缺點①佐劑常混有微量其它物質，這些物質進入體內后也可引起抗體的產主，影響抗血清的特異性；（四）應用佐劑的缺點②注射佐劑可引起局部形成肉芽腫和無菌性膿腫；③反復注射，易發生超敏反應，使局部組織壞死，甚至引起動物死亡。第36頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三

三、免疫動物一）、動物的選擇

1.抗原與免疫動物種屬差異越遠越好；2.動物個體選擇:

適齡、健壯、無感染正常動物、體重合乎要求；3.抗原性質:酶類—豚鼠；甾體激素—家兔

4.血清用途:

R型:等價帶寬,適于診斷試劑.用家兔免疫產生.

H型:等價帶窄,適于免疫治療.用馬免疫產生.5.抗血清需要量選擇:第37頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三

三、免疫動物二）、免疫方法

1.免疫劑量：1)不能過大或過小，否則產生免疫耐受；2)首次免疫劑量不宜過大3)大:0.5-1mg/只小:0.1-0.6mg/只2.免疫途徑：3.免疫間隔時間：

第38頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三2.免疫途徑1）.皮內或皮下注射：

a.采用多點注射(8-10點)；

b.半抗原宜皮內多點注射；

c.皮內注射易引起細胞反應，對提高抗體效價有利，但皮內注射較困難(因佐劑加入后粘度大)。2）.腹腔和靜脈注射:

多用于顆粒性抗原和加強免疫。3）.淋巴結內注射:

適宜于微量抗原(先用完全佐劑在足掌作基礎免疫)。第39頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三3.免疫時間第二次第三次第一次第四次1）.間隔約10-20天（宜長、否則導致免疫耐受）；2）二次以后每次間隔7~10天（過長→刺激變弱→抗體效價不高。）第40頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三3)一般接種5-8次4)半抗原的免疫間隔要求較長(30~40天)。如8次免疫后仍不產生抗體，則應更換動物。第41頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三四、試血效價測定

采血(末次免疫5-7天及時采血)

補充免疫效價不合格

效價合格

免疫3-5次第42頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三五、采血頸動脈采血法：家兔、綿羊、山羊

心臟采血法：

家兔、豚鼠、大鼠、雞

靜脈采血法：

家兔、山羊、綿羊

第43頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三六、免疫血清的純化免疫血清是成分復雜的混合物，除有特異性和非特異性抗體，還有各種蛋白成分。純化目的是除去這些不相關成分，防止抗血清中其他雜抗體及蛋白干擾試驗結果。第44頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三抗血清IgG類抗體（不純）硫酸銨鹽析多次（粗提）特異性IgG抗體凝膠過濾離子交換層析親和層析吸附法親和層析第45頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三1.效價的鑒定：即為抗體含量的測定

根據抗原性質不同，可采取不同抗體效價測定方法。顆粒性抗原可采用凝集試驗。可溶性抗原常用免疫雙擴散法。2.抗體的純度鑒定：SDS－PAGE。

若只出現一條蛋白電泳區帶說明抗體純化已達到要求，而出現多條蛋白區帶則表明抗血清中混有雜蛋白，必須進一步純化。七、抗體的鑒定第46頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三3.特異性鑒定：抗體對相應或相似抗原識別能力

一般用特異性抗原及其相似的抗原與待鑒定抗體進行免疫雙擴散試驗。如果出現交叉反應，說明有雜抗體存在。可應用相應抗原吸收雜抗體，即可得到單價特異性抗體。4.抗體親和力鑒定：親和力高則靈敏度好親和力測定主要有平衡透析法、酶聯免疫法和放射分析法。親和力的高低是由抗原分子和抗體分子的結合位點、抗原決定簇之間立體構型的合適度決定的。七、抗體的鑒定第47頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三八、免疫血清的保存1.4℃保存：可保存3～6個月2.低溫保存：-20～-40℃，可保存2～3年抗體的保存濃度為20～30mg/ml為宜，加入1/10000的硫柳汞或1/1000的疊氮鈉防腐，并加入等體積的中性甘油，分裝小瓶，置-20℃以下低溫保存。3.冰凍干燥保存：可保存5～10年第48頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三舉例：抗人白蛋白的制備1、抗原的準備：分別抽取數人全血，分離血清并混勻；分離制備白蛋白(請問可用哪些方法？)2、佐劑的準備：

福氏不完全佐劑：稱取羊毛脂5g，逐滴加入石蠟油20ml高壓滅菌后4℃保存備用。

福氏完全佐劑：于不完全佐劑中加入2~20mg/ml卡介苗，研缽中缽磨乳化后即成為完全佐劑，冰箱保存備用。第49頁，共54頁，2023年，2月20日，星期三3、抗原-福氏完全佐劑的制備：

取混合人全血清，用生理鹽水作1：4稀釋。將稀釋血清與完全佐劑1：1體積