植物組織培養培養基及操作技術演示文稿當前1頁，總共153頁。優選植物組織培養培養基及操作技術ppt當前2頁，總共153頁。第一節培養基的成分和種類當前3頁，總共153頁。一、培養基的成分當前4頁，總共153頁。1、無機營養元素(inorganicelement)1)大量元素：指濃度大于0.5mmol／L的元素。

[N、P、K、Mg、S和Ca等]。2)微量元素：指小于0.5mmol／L的元素。

[Fe，B，Mn，Cu，Mo，Cl等]。當前5頁，總共153頁。在細胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動。種類：VBl(鹽酸硫胺素)、

VB6(鹽酸吡哆醇)、

Vpp(煙酸)、

Vc（抗壞血酸）、

VH(生物素)、

VB11(葉酸)、

VB12（鈷胺素)等。使用濃度：一般用量為0.1—1.0mg／L。2、維生素(vitamin)當前6頁，總共153頁。又叫環己六醇，在糖類的相互轉化中起重要作用。使用濃度：一般為lOOmg／L，作用：適當使用肌醇，能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。3、肌醇培養基及其配制當前7頁，總共153頁。作用：是很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。種類：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。使用濃度：為10—200mg／L。4、氨基酸(aminoacid）培養基及其配制當前8頁，總共153頁。5、有機附加物（天然復合物）10%—20%150-200ml／L150—200g／L0.01%-0.05%濃度：培養基及其配制當前9頁，總共153頁。6、植物生長調節物質(hormone)赤霉素（gibberellicacid）細胞分裂素類(cytokinin)生長素類(auxin)培養基及其配制當前10頁，總共153頁。

*作用：主要被用于誘導愈傷組織形成；促進細胞脫分化；促進細胞伸長；促進生根。

在促進生長方面，根對生長素最敏感。在極低的濃度下，(10-5—10-8mg／L)就可促進生長，其次是莖和芽。（1）生長素類培養基及其配制當前11頁，總共153頁。吲哚乙酸：IAA（indoaceticacid）萘乙酸：NAA（naphthaleneaceticacid）吲哚丁酸：IBA（indolebutyricacid）2,4-二氯苯氧乙酸：2,4—D(2,4-dichlorophenoxybutyricacid)生長素種類：培養基及其配制當前12頁，總共153頁。生長素作用強弱順序：IAA(吲哚乙酸)NAA(萘乙酸)IBA(吲哚丁酸)2,4—D(2,4—二氯苯氧乙酸)強弱培養基及其配制當前13頁，總共153頁。種類：6—BA(6—芐基腺嘌呤)Kt(kinetin激動素)Zt(zeatin玉米素)（2）細胞分裂素類

細胞分裂素作用：①促進細胞分裂與擴大。②誘導芽分化，促進側芽萌發，使莖增粗，抑制莖伸長。③抑制根的分化。培養基及其配制當前14頁，總共153頁。細胞分裂素作用強弱順序Kt(激動素)6—BA(6—芐基腺嘌呤)Zt(玉米素)強弱培養基及其配制當前15頁，總共153頁。GA3（赤霉酸）：作用：促進幼芽伸長生長，促進不定胚發育成小植株。

赤霉素和生長素協同作用，對形成層的分化有影響：當生長素／赤霉素比值高時有利于木質部分化，比值低時有利于韌皮部分化。（3）赤霉素培養基及其配制當前16頁，總共153頁。7、培養材料的支持物---瓊脂(agar)固體培養時最好的固化劑。用量：6—10g／L。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關外，還與高壓滅菌時的溫度、時間、pH值等因素有關，長時間的高溫會使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會使瓊脂發生水解，喪失凝固能力。時間過久，瓊脂變褐，也會逐漸喪失凝固能力。

培養基及其配制當前17頁，總共153頁。固體培養基的特點（與液體培養基相比）:優點:操作簡便，通氣問題易解決，便于觀察研究。缺點:培養物與培養基的接觸(即吸收)面積小，各種養分在瓊脂中擴散較慢，影響養分充分利用，同時培養物排出的代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產生毒害作用。固體培養液體培養培養基及其配制當前18頁，總共153頁。8、抗生物質(antibiotic)種類：卡那霉素、頭孢霉素、青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。濃度：5—20mg/L。作用：可防止菌類污染。培養基及其配制當前19頁，總共153頁。9、活性炭(activecarbon)目的：是利用其吸附能力，減少一些有毒物質的影響；利于生根。使用濃度：1—5g／L。它的顆粒大小決定著吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；溫度低吸附力強，溫度高吸附力減弱，甚至不吸附。培養基及其配制當前20頁，總共153頁。10、水（water)作用：是植物原生質體的組成成分，也是一切代謝過程的介質和溶媒。注意：用蒸餾水，最好是重蒸餾水；以保持培養基成分的精確性。大規模生產時可用自來水。培養基及其配制當前21頁，總共153頁。二、培養基的PH值(pHvalue)1、多數植物要求2、用0.1-1N的NaOH和0.1-1N的HCI調節.3、注意：經高壓滅菌后，培養基pH會下降0.2-0.8,故調整pH值時,應高于0.5；pH的大小會影響瓊脂的凝固能力，當pH>6.0時，培養基將會變硬，pH<5.0時，瓊脂凝固不好。培養基及其配制當前22頁，總共153頁。種類最適pH值種類最適pH值杜鵑4.0月季5.8越桔4.5胡蘿卜、石刁柏6.0蠶豆5.5桃7.0番茄5.7

培養基及其配制不同植物對培養基最適pH值的要求不同(見表)當前23頁，總共153頁。

培養基(culturemedium)：是植物組織培養的重要基質。在離體培養條件下，不同種植物的組織對營養有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養的要求也不相同。因此，沒有一種培養基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養系統時，首先必須找到一合適的培養基，培養才有可能成功。

三、培養基的種類、配方及特點培養基及其配制當前24頁，總共153頁。1、根據態相不同：固體培養基、液體培養基2、根據培養物培養過程：初代培養基、繼代培養基3、根據作用不同：誘導培養基、增殖培養基、生根培養基4、根據營養水平：基本培養基、完全培養基、改良培養基。（一）培養基的種類培養基及其配制當前25頁，總共153頁。

若只含有大量元素與微量元素和碳水化合物的培養基，稱為基本培養基。

在基本培養基的基礎上，添加各種各樣的生長調節物質和其他有機附加物的培養基叫完全培養基。初代培養基：

指用來第一次接種外植體的培養基。

繼代培養基：

指用來接種初代培養之后培養物的培養基。培養基及其配制當前26頁，總共153頁。1、MS培養基：它是1962年由Murashige和Skoog為培養煙草細胞而設計的。是目前應用最廣泛的培養基。特點：是無機鹽離子濃度較高，有高含量的N、K，硝酸鹽量大，營養豐富。（三）常用的培養基及特點培養基及其配制當前27頁，總共153頁。成分名稱藥品名稱

原配方量(mg)/L大量元素

NH4NO31650KNO31900CaCl2·2H2O440MgSO4·7H2O370KH2PO4170微量元素MnSO4·H2O22.3ZnSO4·7H2O8.6CoCl2·6H2O0.025CuSO4·5H2O0.02H3BO36.2Na2MoO4·2H2O0.25KI0.83鐵鹽FeSO4·7H2O28.7Na2-EDTA37.3有機物煙酸(Vpp)0.5鹽酸吡哆醇0.5鹽酸硫胺素0.1肌醇100甘氨酸2（二）MS培養基配方當前28頁，總共153頁。2、White培養基：1943年由White為培養番茄根尖而設計的。特點：無機鹽濃度較低，適于生根培養。3、N6培養基：1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養而設計的。特點：成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含鉬。在國內已廣泛應用于小麥、水稻及其他植物的花粉和花藥培養。培養基及其配制當前29頁，總共153頁。(4)B5培養基:是1968年由Galmborg等為培養大豆根細胞而設計的。特點：是含有較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素。(5)KM—8P培養基:它是1974年為原生質體培養而設計的。特點：是有機成分較復雜，它包括了所有的單糖和維生素。培養基及其配制當前30頁，總共153頁。2、White培養基

◆1943年由White為培養番茄根尖而設計

◆

1963年作了改良，提高MgSO4的濃度和增加硼元素◆無機鹽濃度較低◆使用廣泛◆在生根培養、胚胎培養中有良好的效果大量元素含量(mg/L）微量元素含量鐵鹽含量有機物含量(mg/L其他含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇100蔗糖30000Ca(NO3)24H2O300MnSO44H2O7.0煙酸0.3瓊脂8000MgSO47H2O720ZnSO47H2O3.0鹽酸硫胺素0.1

NaH2PO44H2O16.5MoO30.0001鹽酸吡哆醇0.1KCl65CuSO45H2O0.001甘氨酸3Na2SO4200當前31頁，總共153頁。3、B5培養基◆1968年由Gamborg等為培養大豆根細胞而設計◆含有較低的銨鹽◆較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素組成成分數量(mg/l）組成成分數量(mg/l)KNO3

2500FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O150CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O250蔗糖40(NH4)2SO4134pH5.5KI0.75肌醇100H3BO43.0煙酸1.0MnSO4·4H2O10鹽酸吡哆醇1.0ZnSO4·7H2O2.0激動素0.1Na2MoO4·2H2O0.252,4－D0.1－1.0CoCl2·6H2O0.025鹽酸硫銨素10Na2-EDTA37.3

B5培養基的組成和配方當前32頁，總共153頁。4、N6培養基

◆1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養設計

◆

KH2PO4和（NH4）SO4含量高，不含鉬組成成分數量(mg/l)組成成分(mg/l)KNO3

2.3Na2－EDTA37.3CaCl2·2H2O166FeSO4·7H2O27.8MgSO4·7H2O185蔗糖50KH2PO4

400pH5.8(NH4)2SO4

463煙酸0.5KI0.8鹽酸吡哆醇0.5H3BO31.6甘氨酸2.0MnSO4·4H2O4.4鹽酸硫銨1.0ZnSO4·7H2O1.5N6培養基組成及配方當前33頁，總共153頁。第二節培養基的配制當前34頁，總共153頁。

一、培養基的配制（一）、母液(stocksolution)的配制和保存所謂母液是欲配制液的濃縮液。意義:

①保證各物質成分的準確性②配制時的快速移取③便于低溫保藏。一般母液配成比所需濃度高10-100倍。母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類等。培養基及其配制當前35頁，總共153頁。單配法：將培養基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用mg/ml或mg/L表示。混配法：將幾類營養成分按配方中的用量擴大一定倍數稱量，分別溶解后再混合成母液。配制生長素類：可先用少量0.1N的NaOH或95%酒精助溶。濃度為：1-5mg／ml。配制細胞分裂素類：一般先用少量0.5-1N鹽酸加熱溶解。濃度為：1-5mg／ml。培養基及其配制

母液的配制方法：當前36頁，總共153頁。ＭＳ培養基母液的配制母液名稱藥品名稱

原配方量(mg)/L擴大倍數

稱取量

(mg)母液體積

(ml)

移取量

(ml)/L大量元素母液

NH4NO3165010165001000100KNO319001019000CaCl2·2H2O440104400MgSO4·7H2O370103700KH2PO4170101700微量元素母液MnSO4·H2O22.31002230100010ZnSO4·7H2O8.6100860CoCl2·6H2O0.0251002.5CuSO4·5H2O0.0210025H3BO36.2100620Na2MoO4·2H2O0.2510025KI0.8310083鐵鹽母液FeSO4·7H2O28.71002870100010Na2-EDTA37.31003730有機物母液煙酸(Vpp)0.5502550010鹽酸吡哆醇0.55025鹽酸硫胺素0.1505肌醇100505000甘氨酸250100培養基及其配制當前37頁，總共153頁。配制方法：1）、將母液按順序擺放2）、取適量的蒸餾水(所需培養基量的2/3)入容器3）、按需要量依次取母液及生長調節物質4）、加入蔗糖(30g/L)溶解5）、加瓊脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min5）、定容6)、調PH值(pH=5.8)7)、分裝培養瓶，封口8)、高壓滅菌培養基及其配制當前38頁，總共153頁。當前39頁，總共153頁。第三節

組培技術（滅菌、接種、培養、移栽馴化）當前40頁，總共153頁。消毒:是指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發生危害作用。滅菌:是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質全部殺死。培養基及其配制一、培養基的滅菌當前41頁，總共153頁。常用的滅菌方法物理方法化學方法干熱滅菌(烘燒和灼燒)濕熱滅菌(常壓或高壓蒸煮)射線處理(紫外線、超聲波、微波)過濾除菌大量無菌水沖洗升汞(氯化汞)甲醛(福爾馬林)過氧化氫高錳酸鉀來蘇兒漂白粉次氯酸鈉酒精培養基及其配制當前42頁，總共153頁。培養基的滅菌－濕熱滅菌法培養基在制備后的24h內完成滅菌。高壓滅菌的原理：

在密閉的蒸鍋內，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。在108kPa的壓力下，鍋內溫度達121℃。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。培養基及其配制當前43頁，總共153頁。將鍋內空氣完全排除后，關閉放氣閥。當壓力表上升達108kPa時，鍋內溫度達121℃（在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢），維持15-30min。培養基及其配制滅菌方法：當前44頁，總共153頁。當前45頁，總共153頁。

滅菌鍋有很多種，實驗室中常用手提式高壓蒸汽滅菌鍋，使用時要注意一下幾點：1、鍋中應放足量的水，以免造成空燒或干燒；2、裝鍋時不要過度傾斜，可保持內部有一定的空間，利于蒸汽流動；3、增壓前高壓鍋內的空氣必須排凈，否則易影響滅菌效果；當前46頁，總共153頁。4、滅菌過程中，應盡量保持壓力恒定，嚴格遵守滅菌時間；5、排氣降壓時應緩慢進行；6、只有待高壓鍋內壓力表指針恢復到零后，才能開啟壓力鍋；7、高壓鍋工作時，應有專人看守。當前47頁，總共153頁。高壓滅菌的原理在密閉的蒸鍋內，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內溫度達121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。當前48頁，總共153頁。注意事項

完全排除鍋內空氣，使鍋內全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關閉放氣閥。關閥再通電后，壓力表上升達到0.1MPa時,開始計時，維持壓力0.1～0.15MPa20分鐘。當前49頁，總共153頁。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時，由氣態變為液態時可放出2．26kJ（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。

在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生污染，需逐漸減壓。

當前50頁，總共153頁。過濾滅(除)菌（不耐熱的物質）一些生長調節劑(赤霉素、玉米素)、某些維生素是不耐熱的，常用過濾滅菌-細菌過濾器方法。防細菌濾膜網孔的直徑為0.45μm以下，可阻止細菌細胞和真菌的孢子通過。培養基及其配制當前51頁，總共153頁。空間及物體表面滅菌培養基及其配制熏蒸劑:甲醛和高錳酸鉀，1周后通風1天。(1)紫外線滅菌(2)熏蒸滅菌10-20分鐘當前52頁，總共153頁。

◆滅菌后的培養基經冷卻和凝固后即可使用，檢驗滅菌效果。檢驗方法：將培養基置于培養室中3天，若沒有污染現象，說明滅菌可靠，可以使用。

◆保存在低溫條件下。常溫下保存時要進行防塵和避光處理。

◆保存時間不可過長。培養基的保存當前53頁，總共153頁。二、外植體的選擇和滅菌

1、外植體的選擇

2、外植體的滅菌方法

3、污染原因和預防措施

當前54頁，總共153頁。1、外植體的選擇

植物組織培養的主要過程大致包括：培養基的制備、外植體的選擇、器具的消毒、無菌操作和環境條件的調控。

1）、選擇優良的種質

無論是離體培養繁殖種苗，或者是進行生物技術研究，選取性狀優良的種質，或特殊的基因型。對材料的選擇要有明確的目的，具有一定的代表性，提高成功機率，增加其實用價值。

當前55頁，總共153頁。2）、選擇健壯的植株

組織培養用的材料，最好從生長健壯的無病蟲的植株上，選取發育正常的器官或組織。因為這些器官或組織代謝旺盛，再生能力強，比較容易培養成功。3）、選擇最適的時期組織培養選擇材料時，要注意植物的生長季節、植物的生長發育階段。如快速繁殖時應在植株生長的最適時期取材，這樣不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高。當前56頁，總共153頁。4）、選取適宜的大小

培養無菌材料時，取材的大小根據不同植物材料而異。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活。一般選取培養材料的大小，在。如果是胚胎培養或脫毒培養的材料，則應更小。當前57頁，總共153頁。三、外植體的滅菌方法1、常用滅菌藥劑的使用和效果2、外植體的滅菌方法當前58頁，總共153頁。1、常用滅菌藥劑的使用和效果滅菌劑使用濃度（%）清除的難易消毒時間效果次氯酸鈣9—10易5—30很好次氯酸鈉2易5—30很好漂白粉飽和濃度易5—30很好氯化汞0.1—1較難2—10最好酒精70—75易0.2—2好過氧化氫10—12最易5—15好溴水1—2易2—10很好硝酸銀1較難5—30好抗菌素4—50mg/L中30—60較好當前59頁，總共153頁。2、外植體的滅菌方法

外植體在接種前先要滅菌，在滅菌前，又先要進行預處理。植物材料一般采取的預處理方法是：先對植物組織進行修整，去掉不需要的部分，將準備使用的植物材料在流水中沖洗干凈。經過預處理的植物材料，其表面仍有很多細菌和真菌，因此還需進一步滅菌。

當前60頁，總共153頁。常規的表面滅菌處理方法①把材料放進70%的酒精中約30s。②用0.1%的升汞（HgCl2）浸泡5～10min

。

或用10%的次氯酸鈉溶液浸泡10～15min。③無菌蒸餾水沖洗3～5次。④滅菌時進行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好的接觸。⑤在滅菌劑里滴入數滴0.1%的Tween20（吐溫）

或Tween80濕潤劑，則滅菌效果更好。

當前61頁，總共153頁。四、污染原因和預防措施1、污染的原因污染——是指在組織培養過程中培養基和培養材料滋生雜菌，導致培養失敗的現象。污染的原因：從病原菌方面來分析主要有細菌及真菌兩大類；從污染的途徑而言，主要是由于外植體帶菌、培養基及器皿滅菌不徹底、操作人員未遵守操作規程等引起的。當前62頁，總共153頁。細菌污染的特點：在外植體附近的培養基中出現渾濁和云霧狀痕跡。一般在接種后1～2天即可發現。原因：材料帶菌；培養基滅菌不徹底；操作人員未遵守操作規程。因此接種人員的手應經常用70%酒精擦洗，鑷子、剪刀、接種針在使用前必須在火焰上燒紅。當前63頁，總共153頁。真菌污染的特點：培養瓶內往往會出現白、黑或綠等不同顏色菌絲塊。在接種后3～10天才能發現。原因：周圍環境不清潔；超凈工作臺的過濾裝置失效；培養瓶等器皿的口徑過大。為了減少損失，提高工作效率，必須在每個操作環節注意防止污染的發生。當前64頁，總共153頁。2、污染的預防措施發現污染的材料應及時處理，否則將導致培養室環境污染。對一些特別寶貴的材料，可以取出再次進行更為嚴格的滅菌，然后接入新鮮的培養基中重新培養。要處理的污染培養瓶最好在打開瓶蓋前，先集中進行高壓滅菌，再清除污染物，然后洗凈備用。當前65頁，總共153頁。1）防止材料帶菌的措施（1）用莖尖作外植體時，可在室內或無菌條件下對枝條先進行預培養。枝條

水洗凈

插入無糖的營養液或自來水抽枝以這種新抽的嫩枝條作為外植體

接種。這樣便可大大減少材料的污染。在無菌條件下對采自田間的枝條進行暗培養，待抽出的黃化枝條時采枝，經滅菌后接種也可明顯減少污染。當前66頁，總共153頁。

（2）選擇合適的時間去田間采取外植體避免陰雨天去田間采取外植體。在晴天采取外植體時，下午采取的外植體要比早晨采的污染少，因材料經過日曬后可殺死部分細菌或真菌。當前67頁，總共153頁。

但目前對材料內部污染還沒有令人滿意的滅菌方法。在菌類長入組織內部時，不但要除去上年生的鱗片，甚至要除去韌皮組織，只接種內部的分生組織，以收到一定的防污染效果。當前68頁，總共153頁。2）外植體的滅菌（1）多次滅菌法：首先除去主脈（因主脈與支脈交界處常有真菌休眠孢子存在）；其次，將切好的外植體放入1.3%的次氯酸鹽溶液中，滅菌30min；第三，在無菌蒸餾水中沖洗3-5次；第四，將材料封閉在無菌的培養皿中過夜，保持一定溫度；第五，次日將葉片用2.6%次氯酸鈉滅菌30min，然后用蒸餾水洗3-5次。當前69頁，總共153頁。（2）多種藥液交替浸泡法

對容易污染而難滅菌的材料：首先取莖尖、芽或器官外植體，用自來水及肥皂充分洗凈，表面不可附著污垢、灰塵，用剪刀修剪掉外植體上無用的部分，剝去芽上鱗片；第2，將材料放入70%酒精中滅菌數秒鐘；第3，在1：500RoccalB（一種商品滅菌劑名）稀釋液中浸5min；第4，放入5%—10%次氯酸鈉溶液中并滴入“吐溫80”數滴，滅菌15—30min，或浸入0.1%—0.2%升汞溶液中并加入“吐溫80”數滴，滅菌5—10min；第5，用無菌水沖洗5次。也可從次氯酸鈉溶液中取出后，再放入無菌的0.1M鹽酸中浸片刻，再用無菌水沖洗數次。當前70頁，總共153頁。3）玻璃器皿的滅菌濕熱滅菌法——即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅菌鍋中進行高溫高壓滅菌，滅菌時間可延長達25min—30min。干熱滅菌法——即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進行滅菌。煮沸滅菌——即將玻璃器皿放入水中煮沸進行滅菌。當前71頁，總共153頁。4）金屬器械的滅菌

火焰滅菌法：即把金屬器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。這一步驟應當在無菌操作過程中反復進行。干熱滅菌法：即將擦洗干凈或烘干的金屬器械用紙包好，盛在金屬盒內，放在烘箱中滅菌。當前72頁，總共153頁。濕熱滅菌法：工作服、口罩、帽子等布質品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的布質品，放入高壓鍋中，121C的溫度，滅菌20min～30min。5）布質制品的滅菌

當前73頁，總共153頁。6）無菌操作室的滅菌

無菌操作室的地面、墻壁和工作臺的滅菌可用2%的新潔爾滅或70%的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約20-30min。使用前用70%的酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。當前74頁，總共153頁。7）操作人員在接種時一定要嚴格按照無菌操作的程序進行當前75頁，總共153頁。在接種前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，最好在新潔爾滅溶液中浸泡10min，后用75%的酒精擦手，并用75%的酒精擦拭接種瓶表面進行消毒，以防把微生物帶進超凈工作臺。工作人員在接種時，最好不要感冒咳嗽和說話。操作人員操作動作要熟練、動作快、規范，這樣可以縮短操作時間，減少污染。如脫毒培養的莖尖很小，操作時間長了就會使莖尖失水變干，或不慎感染雜菌。

當前76頁，總共153頁。小結1、外植體的選擇：優良種質、健壯植株、最適的時期、適宜的大小。2、外植體的滅菌方法：9種常用滅菌藥劑的使用及其效果、外植體的滅菌方法。3、污染原因和預防措施：污染的原因、污染的預防措施（防止材料帶菌、外植體的滅菌、器皿與金屬器械的滅菌、布質制品的滅菌、無菌操作室的滅菌、操作人員在接種時一定要嚴格按照無菌操作的程序進行）。當前77頁，總共153頁。四、外植體的接種和培養

1、外植體的接種

2、培養條件當前78頁，總共153頁。

1、外植體的接種

外植體的接種——是把經過表面滅菌后的植物材料在無菌環境中切割或分離出器官、組織、細胞并轉入到無菌培養基上的全部操作過程。操作過程中引起的污染，主要由空氣中的雜菌和工作人員本身引起的。因此除接種室空氣消毒外，應特別注意防止工作人員本身引起的污染。整個接種過程均須無菌操作：當前79頁，總共153頁。酒精擦拭手外植體消毒浸泡5min器械消毒酒精燈灼燒接種的具體操作當前80頁，總共153頁。旋轉灼燒取外植體接種蓋好瓶塞當前81頁，總共153頁。1．操作人員需穿著經消毒的白色工作服，戴口罩、帽子、鞋套。進入接種室前，雙手必須進行消毒，用肥皂和水洗滌能達到良好的效果,進行操作前再用75%的酒精擦洗雙手。2．操作期間經常用75%的酒精擦拭雙手和臺面。特別注意防止“雙重傳遞”的污染，例如器械被手污染后又污染培養基等。當前82頁，總共153頁。3．在打開培養瓶、三角瓶或試管時，最大的污染危險是管口邊沿沾染的微生物落入管內，解決這個問題，可在打開前用火焰燒瓶口。如果培養液接觸了瓶口，則瓶口要燒到足夠的熱度，以殺死存在的細菌。為避免灰塵污染瓶口，可用紙包扎瓶口和塞子，以遮蓋瓶子頸部和試管口，相對地減少污染機會。當前83頁，總共153頁。4．工具用后及時消毒，避免交叉污染。5．工作人員的呼吸也是污染的主要途徑。通常在平靜呼吸時細菌是很少的，但是談話或咳嗽時細菌便增多，因此操作過程應禁止不必要的談話并戴上口罩。當前84頁，總共153頁。6．由于空氣中有灰塵，因此在操作時，仍要注意避免灰塵的落入。盡量把蓋子蓋好，當打開瓶子或試管時，應拿成斜角，以免灰塵落入瓶中。刀、剪、鑷等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用時在火焰上消毒，待冷卻后使用。每次使用前均需進行用具消毒。

當前85頁，總共153頁。外植體的培養條件

接種后的外植體應送到培養室去培養。組織培養的優點之一就是在人工控制的環境條件下，使培養物生長發育，研究植物的生命活動。培養室的培養條件要根據植物對環境條件的不同需求進行調控。其中最主要的是光照、溫度、濕度、氧氣和培養基的pH值等。當前86頁，總共153頁。1、光照對離體培養物的生長發育，光照條件有重要的作用。通常對愈傷組織的誘導，在黑暗條件下有利，在有光條件下培養的愈傷組織質地和顏色也有不同。但分化器官需要光照，并隨著芽苗的生長需要加強光照。加強光照，可以使小苗生長健壯，促進“異養”向“自養”轉化，提高移植的成活率。普通培養室要求每日光照12h-16h，光照強度1000lx-5000lx。如果培養材料要求在黑暗中生長，可用鋁箔或者適合的黑色材料包裹在容器的周圍，或置于暗室中培養。當前87頁，總共153頁。2．溫度離體培養中對溫度的調控要比光照顯得更為突出。不同的植物有不同的最適生長溫度，大多數植物最適溫度在23C-32C之間。培養室一般所用的溫度是25C±2C。低于15C或高于35C，對生長都是不利的。當前88頁，總共153頁。3．濕度組織培養中的濕度影響主要有兩個方面，一是培養容器內的濕度，它的濕度條件常可保證100%。二是培養室的濕度，它的濕度變化隨季節和天氣而有很大變動。濕度過高過低都是不利的，過低會造成培養基失水而干枯，或滲透壓升高，影響培養物的生長和分化；濕度過高會造成雜菌滋長，導致大量污染。因此，要求室內保持70%-80%的相對濕度。當前89頁，總共153頁。4．氧氣植物組織培養中，外植體的呼吸需要氧氣。在液體培養中，振蕩培養是解決通氣的良好辦法。當前90頁，總共153頁。

低CTK/IAA外植體愈傷組織芽根脫分化再分化低CTK/IAA根

完整植株生長調節物質控制器官分化的模式芽高CTK/IAA低CTK/IAA當前91頁，總共153頁。當前92頁，總共153頁。

不定芽形成---多細胞參與胚狀體形成過程--單細胞參與體細胞胚的發育過程當前93頁，總共153頁。五、試管苗的馴化與移栽試管苗的特點1.試管苗的生態環境

組織培養中培育出來的苗通常稱試管苗或組培苗。由于試管苗長期生長在試管或三角瓶等培養器皿中，與外界環境隔離，形成了一個獨特的生態系統。與外界環境條件相比具有以下4大差異，即高溫、高濕、弱光和無菌。當前94頁，總共153頁。（1）高溫且恒溫在植物試管苗整個生長過程中，通常均采用恒溫培養，即使某一階段稍有變動，溫差也是極小的；并且在培養過程中，通常溫度控制在25℃±2℃，有的植物需將溫度控制得更高；而外界環境條件，溫度處于不斷變化之中，溫度的調節完全是由自然界太陽輻射的日輻射量決定的，溫差很大，而且一般不會達到25℃±2℃。當前95頁，總共153頁。（2）高濕植物組織培養中試管或培養瓶內的水分移動有2條途徑，一是試管苗吸收的水分，從葉面氣孔蒸騰；二是培養基向外蒸發，而后水汽凝結又進入培養基。這種循環就是培養瓶內的水分循環，其循環的結果造成培養瓶內空氣的相對濕度接近于100％，遠遠大于培養瓶外的空氣濕度，所以試管苗的蒸騰量極小。可見培養瓶內的水分狀態直接影響著試管苗的生長和各種生理活性。當前96頁，總共153頁。（3）弱光組織培養中的光強與太陽光相比一般很弱，故幼苗一般生長也較弱，經受不了太陽光的直接照射。當前97頁，總共153頁。（4）無菌不僅培養基無菌，而且試管苗也無菌。在移栽過程中試管苗要經歷由無菌向有菌的轉換。這一點若不注意，也會引起試管苗移栽過程中的死亡。另外，試管苗還處在一種特殊的氣體環境中。以上這些特點都決定了試管苗移栽前后的環境條件有極大的差異，只有有效地使試管苗適應這種差異，才能使之移栽成活，這就需要試管苗有一定的馴化時期。當前98頁，總共153頁。2.試管苗的特點試管苗與常規苗相比具有如下特點：1、試管苗生長細弱，莖、葉表面角質層不發達；2、試管苗莖、葉雖呈綠色，但葉綠體的光合作用功能較差；3、試管苗的葉片氣孔數目少，活性差4、試管苗根的吸收功能弱。當前99頁，總共153頁。二、試管苗的馴化

馴化的目的:在于提高試管苗對外界環境條件的適應性，提高其光合作用的能力，促使試管苗健壯，最終達到提高試管苗的移栽成活率。當前100頁，總共153頁。

馴化的原則：應從溫度、濕度、光照及有菌等環境要素進行，馴化開始數天內，應和培養時的環境條件相似；馴化后期，則要與預計的栽培條件相似，從而達到逐步適應的目的。

當前101頁，總共153頁。

馴化的方法：馴化一般在試管苗移栽前進行，首先進行移栽前的馴化鍛煉（即練苗），其具體方法：將長有完整試管苗的試管或三角瓶由培養室轉移到半遮蔭的自然光下進行鍛煉，在自然光下恢復植物體內葉綠體的光合作用能力和健壯度，并打開瓶蓋注入少量自來水使幼苗逐漸降低溫度，轉向有菌，這樣幼苗周圍的環境就會逐步與自然環境相似。馴化一般進行1～2周。當前102頁，總共153頁。三、試管苗的移栽

試管苗的移栽往往和馴化同步。移栽的方法有：常規移栽法、直接移栽法和嫁接移栽法。

當前103頁，總共153頁。1．常規移栽法常規移栽法是指將試管苗在生長素濃度高的培養基上誘導生根，當獲得大量的不定根后，打開培養瓶注入少量自來水，在半遮光下馴化3～5d，然后取出洗去培養基，移栽到無菌的混合土（如沙子：蛭石=1：1）中，保持一定的溫度和水分，當長出2～3片新葉時就可將其移栽到田間或盆缽的方法。當前104頁，總共153頁。2．直接移栽法直接移栽法是指直接將試管苗移栽到盆缽的方法。3．嫁接移栽法嫁接移栽法是指選取生長良好的同一植物的實生苗或幼苗作砧木，用試管苗作接穗進行嫁接的方法。據王清連等人對棉花的試管苗進行嫁接移栽試驗表明，試管苗的嫁接移栽法與常規移栽法相比優點見下表：當前105頁，總共153頁。試管苗種類移栽方法移栽植株數成活植株數成活率（%）嫁接移栽法353394.29壯苗常規移栽法502448.00直接移栽法2100.00嫁接移栽法302170.00弱苗常規移栽法2727.41直接移栽法1500.00表2-4嫁接移栽法移栽棉花試管苗的效果當前106頁，總共153頁。四、影響試管苗移栽成活率的因素

影響試管苗移栽成活率的因素有許多種，包括內因與外因。不同的植物和不同的試管苗種類對移栽的具體要求是不同的。但是總的來說，提高試管苗移栽成活率的途徑有以下幾種。當前107頁，總共153頁。

試管苗的馴化藍莓當前108頁，總共153頁。1．試管苗的生理狀況（選擇壯苗）

試管苗的生理狀況是影響移栽成活率的內在因素。同一種植物的試管苗，其壯苗比弱苗移栽后成活率高。當前109頁，總共153頁。試管苗種類移栽方法移栽植株數成活植株數成活率（%）嫁接移栽法353394.29壯苗常規移栽法502448.00直接移栽法2100.00嫁接移栽法302170.00弱苗常規移栽法2727.41直接移栽法1500.00

嫁接移栽法移栽棉花試管苗的效果當前110頁，總共153頁。2．植物生長調節物質一般來說生長素因為能促進生根，故也能提高試管苗移栽的成活率。但是，不同的植物有其適宜的生長素種類。如在月季的試驗中發現，以NAA誘導生根和提高移栽成活率效果最好；而IAA并不理想，當IAA的濃度超過1mg/L時，反而急劇降低移栽成活率。細胞分裂素一般會抑制根的生長，不利于移栽。如在月季的試驗中表明，無論是BA或2-ip對生根和移栽都有抑制效應，即使在很低的濃度下也可發現。當前111頁，總共153頁。3．無機鹽濃度試驗結果表明，降低無機鹽的濃度對植物生根效果較好，有利于移栽成功。當前112頁，總共153頁。4．活性炭在生根培養基中加入少許活性炭，對某些月季的嫩莖生根有良好作用，尤其是采用酸、堿和有機溶劑洗過的活性炭，效果更佳。當前113頁，總共153頁。5．環境因子環境條件也影響試管苗移栽的效果，關鍵是控制好移栽前10d的光、溫、濕。做好適當遮陰工作，避免太陽光直射造成試管苗迅速失水而死亡。溫度一般保持在25℃～30℃為好。開始幾天最好用燒杯罩住移栽苗，使其周圍的相對濕度保持在85%以上。當前114頁，總共153頁。6．從無菌向有菌逐漸過渡試管苗出管后，要將其上面的培養基洗凈，以免雜菌滋長。對于移栽后成活比較困難的植物，第一次移栽時最好選用滅菌過的基質，以提高其移栽成活率。當前115頁，總共153頁。第三節外植體的褐變及其預防措施當前116頁，總共153頁。葡萄嫩莖接種48h馬鈴薯莖尖接種40d當前117頁，總共153頁。

褐變：是指外植體在培養過程中自身組織從表面向培養基釋放出褐色物質，以致培養基逐漸變成褐色，外植體也進一步變褐而死亡的現象。一、褐變的概念當前118頁，總共153頁。

褐變的發生與外植體組織中所含的酚類化合物多少和多酚氧化酶活性有直接關系。酚類很不穩定，溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌類物質和水，醌類又會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質發生聚合，進一步引起其他酶系統失活，從而導致組織代謝紊亂，生長停滯不前，最終衰老死亡。

二、褐變的原因當前119頁，總共153頁。

植物材料不同，褐變的程度有所不同。三、影響褐變的因素棗蝴蝶蘭蘋果環境、培養基、轉接周期不同，褐變的程度不同。當前120頁，總共153頁。1、植物材料（1）基因型

不同種植物，同種植物不同類型、不同品種在組織培養中褐變發生的頻率、嚴重程度都存在很大差別。木本植物（木質素）、單寧含量或色素含量高的植物容易發生褐變。這是因為酚類的糖苷化合物是木質素、單寧和色素的合成前體，酚類化合物含量高，木質素、單寧或色素形成就多，而酚類化合物含量高將導致褐變的發生，因此，木本植物一般比草本植物容易發生褐變。當前121頁，總共153頁。蘋果苜蓿當前122頁，總共153頁。

（2）材料年齡幼齡材料一般都比成齡材料褐變輕的趨勢。幼齡材料褐變較輕與其酚類化合物含量少有關。Chever分析歐洲栗的酚類含量變化的結果表明，幼齡材料酚類化合物含量少，而成齡材料比較多。平吉成從山定子剛長成的實生苗上切取莖尖進行培養，接種后褐變很輕，隨著苗齡增長，褐變逐漸加重，取自成齡樹上的莖尖褐變就更嚴重。當前123頁，總共153頁。梨一年生枝、二年生枝接種3d當前124頁，總共153頁。（3）取材部位

Yu和Meredith在葡萄上發現從側生蔓切取莖尖進行培養，比從延長蔓切取的莖尖更容易成活，進一步分析酚類含量發現前者比后者少。而蘋果則頂芽作外植體褐變程度輕，比側芽容易成活。石竹和菊花也是頂端莖尖比側芽莖尖更容易成活。當前125頁，總共153頁。

（4）取材時期

多酚氧化酶活性和酚類含量基本是對應的，春季較弱，隨著生長季節的到來，酶活性逐漸增強，因而有人認為取材時期比取材部位更加重要。Chever報道，歐洲栗在3月15日-30日醌類物質形成少，而在5月-6月醌類物質明顯提高。

當前126頁，總共153頁。蔣迪軍和牛建新報道，金冠蘋果莖尖小于0.5mm時褐變嚴重,當莖尖長度在5mm-15mm時褐變較輕,成活率可達85%。在多個蘋果品種上試驗結果表明，用5mm-10mm長的莖尖進行培養效果最好，莖尖如果太小很容易發生褐變。另外，取外植體時還要考慮其粗度，細的可切短些，粗的可切得長些。（5）外植體大小當前127頁，總共153頁。

主要是光照與溫度。溫度過高或光照過強，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速外植體的褐變。2、培養條件當前128頁，總共153頁。

（1）培養基狀態由于培養基中瓊脂的用量和pH值的高低不同，培養基可配成固體培養基、半固體培養基或液體培養基。許多試驗證明，液體培養基可以有效克服外植體褐變，液體培養基再加上濾紙橋，效果就更好。在液體培養基中，外植體溢出的有毒物質可以很快擴散，因而對外植體造成的傷害較輕。3、培養基當前129頁，總共153頁。（2）無機鹽

在初代培養時，培養基中無機鹽濃度過高，酚類物質將會大量外溢，導致外植體褐變。原因是無機鹽中的有些離子，如Mn2+、Cu2+是參與酚類合成與氧化酶類的組成成分或輔因子，因此鹽濃度過高會增加這些酶的活性，酶又進一步促進酚類合成與氧化。

當前130頁，總共153頁。（3）植物生長調節物質

初代培養處在黑暗條件下，生長調節物質的存在是影響褐變的主要原因，此時去除生長調節物質可減輕褐變。細胞分裂素6-BA或KT不僅能促進酚類化合物的合成，而且還能刺激多酚氧化酶的活性，這一現象在甘蔗的組織培養中明顯。而生長素類如2，4-D和IAA可延緩酚類化合物的合成，減輕褐變現象發生。

當前131頁，總共153頁。（4）抗氧化劑培養基中加入抗氧化劑可改變外植體周圍氧化還原電勢，從而抑制酚類氧化，減輕褐變。

當前132頁，總共153頁。（5）吸附劑

活性炭和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作為吸附劑可以去除酚類氧化造成的毒害效應，這在東北紅豆杉、豬籠草、鶴望蘭、杜鵑花、蘋果、桃和倒掛金鐘等植物上都有過報道。在倒掛金鐘莖尖培養中只加入0.01%PVP便對褐變有抑制作用。

當前133頁，總共153頁。（6）pH值

培養基的pH值較低時，可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，從而抑制褐變。而pH值升高則明顯加重褐變。當前134頁，總共153頁。4、材料轉瓶周期

對于易褐變的材料，接種后轉瓶時間長，傷口周圍積累醌類物質增多，褐變加重，以致全部死亡。而縮短轉瓶周期可減輕褐變。在山月桂樹的莖尖培養中，接種后12h～24h，便轉入液體培養基中，這之后的一周內，每天轉一次瓶，褐變得到完全控制。在無刺黑莓上也有類似經驗。當前135頁，總共153頁。褐變的預防措施1．選擇適宜的外植體外植體應選擇分生能力較強的材料。如采用實生苗莖尖、枝條頂芽、幼胚等材料培養褐變程度比較輕。2．采用適宜的培養基和光溫條件培養基的無機鹽成分、蔗糖濃度、激素水平、溫度適宜及在黑暗條件下培養，或在取外植體之前對母株進行遮光處理20d～40d，可以顯著減輕材料的褐變。

當前136頁，總共153頁。3．在培養基中加活性炭、抗氧化劑和其他抑制劑在培養基中加入0.1%～0.5%的活性炭對吸附酚類氧化物的效果很明顯。在許多熱帶樹木的組織培養中均曾觀察到活性炭防止外植體褐變的明顯效果。如在培養基中加抗壞血酸、血清蛋白、有機酸、蛋白質、氨基酸等抗氧化劑和其他抑制劑，或用它們進行材料的預處理或預培養，可有效地預防醌類物質的形成。4．縮短轉瓶周期這是組培中控制褐變常用且有效的方法。當前137頁，總共153頁。第四節、玻璃化現象及其預防措施玻璃化現象

是指組培苗出現葉、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小腫脹，失綠，葉片皺縮成縱向卷曲，脆弱易碎；葉表皮缺少角質層蠟質，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織；體內含水量高，但干物質、葉綠素、蛋白質、纖維素和木質素含量低的現象。

當前138頁，總共153頁。二、玻璃化苗的危害性

由于其組織畸