熒光定量技術專題第一頁，共六十五頁，2022年，8月28日內容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR解析方法SYBR法實驗流程及注意事項TIANGEN公司熒光定量產品選擇指南第二頁，共六十五頁，2022年，8月28日實時定量PCR技術：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的關系對起始模板進行定量分析與常規PCR技術比較：對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析，無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測熒光定量PCR原理－－定義第三頁，共六十五頁，2022年，8月28日擴增曲線熒光閾值Ct值熒光定量PCR原理－－常用名詞概念第四頁，共六十五頁，2022年，8月28日Cycle（循環數）Rn（熒光強度）BaselineLg－linerphase平臺期熒光基團熒光檢測元件熒光定量PCR原理－－擴增曲線第五頁，共六十五頁，2022年，8月28日Cycle（循環數）Rn（熒光強度）BaselineLg－linerphase前15個循環信號作為熒光本底信號（baseline）熒光閾值的缺省設置是3～15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍手動設置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進入指數期的最初階段真正的信號:熒光信號超過閾值Threshold熒光定量PCR原理－－熒光閾值平臺期第六頁，共六十五頁，2022年，8月28日Ct值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數Cycle（循環數）Rn（熒光強度）Ctvalue熒光定量PCR原理－－Ct值第七頁，共六十五頁，2022年，8月28日橫軸：PCR反映循環數縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產物量不恒定；Ct值極具重現性Ct值的重現性第八頁，共六十五頁，2022年，8月28日理想的PCR反應Xn＝X02n*Xn：第n次循環后擴增產物數量X0：起始模板數量n：擴增循環數熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數學原理第九頁，共六十五頁，2022年，8月28日非理想的PCR反應Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循環后擴增產物數量X0：起始模板數量n：擴增循環數En：擴增效率熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數學原理第十頁，共六十五頁，2022年，8月28日在擴增產物達到熒光閾值時XCt＝X0（1＋En）Ct＝M（1）*XCt：熒光擴增信號達到閾值時擴增產物的量，在閾值設定以后，它是一個常數，定為M方程式（1）兩邊同取對數得：Log2M＝Log2X0

*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：Log2X0＝Log2M－CtLog2（1＋En）熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數學原理第十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration模板DNA量越多，熒光達到閾值的循環數越少，即Ct值越小。Log模板起始濃度與Ct值呈線性關系。熒光定量PCR原理－－Ct值與模板起始量的關系第十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日線性關系、擴增效率確認檢測靈敏度確認Notemplatecontrol確認標準曲線斜率:-3－-3.535Cycles內可得到好的定量結果如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內無非特異性產物擴增35Cycles內無引物二聚體產生相關系數（R2）：大于0.98熒光定量PCR反應性的確認第十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日內容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR解析方法SYBR法實驗流程及注意事項TIANGEN公司熒光定量產品選擇指南第十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日非特異性熒光標記

SYBRGreenI特異性熒光標記TaqManProbe常用熒光標記方法第十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料。SYBRGreenI第十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日熱變性引物退火延伸反應SYBRGreenI染料法——作用機理第十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日問題點：SYBRGreenI與雙鏈DNA進行結合后散發熒光，因此如果反應體系中有非特異性擴增或引物二聚體的產生，也將同時被檢測，從而可能導致檢測結果不準確。SYBRGreenI染料法——問題點與關鍵點關鍵點：

設計合適引物，防止非特異性擴增！第十八頁，共六十五頁，2022年，8月28日將溫度與熒光強度的變化求導(-dI/dT)原始圖譜對數圖譜SYBRGreenI染料法——融解曲線第十九頁，共六十五頁，2022年，8月28日融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準確融解曲線分析，出現雜峰其他產物出現非特異性熒光，因此定量不準確SYBRGreenI染料法——融解曲線第二十頁，共六十五頁，2022年，8月28日使用方便，不必設計復雜探針具有價格優勢優點

無模板特異性對引物特異性要求較高不能進行多重定量靈敏度相對較低缺點SYBRGreenI染料法——優缺點第二十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日Taqman探針法——原理

5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)探針完整，R發射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針第二十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日Taqman探針法——工作機理熱變性引物和探針與模板退火延伸反應探針報告基團淬滅基團探針DNA聚合酶引物RRRR第二十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日1、引物、探針的設計：

探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反應參數的確定：一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優化退火溫度

3、優化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：100-900nM

探針濃度：50-300nM4、其他與常規PCR相同Taqman探針法——PCR體系的建立第二十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日

高度特異性重復性好靈敏度高可進行多重定量優點

只適合一個特定的目標委托公司標記，價格較高不易找到本底低的探針缺點Taqman探針法——優缺點第二十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日標記熒光的發夾探針環與目標序列互補莖由互補配對序列組成環莖熒光素淬滅劑實時熒光定量PCR的分類－－分子信標第二十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日FRET實時熒光定量PCR的分類－－分子信標第二十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日高特異性：對目標序列檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優點

只能用于一個特定目標設計困難價格比較高缺點實時熒光定量PCR的分類－－分子信標第二十八頁，共六十五頁，2022年，8月28日

幾種方法的應用比較方法優點缺點適用范圍SYBRGreenI方法適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現非特異性帶適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表達量的研究，轉基因重組動植物的研究TaqMan方法特異性高重復性好價格高只適合特定目標病原體檢測，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷MolecularBeacon法(分子信標)高特異性熒光背景低只適合特定目標設計困難價格高特定基因分析SNP分析第二十九頁，共六十五頁，2022年，8月28日

定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等

絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數定量，

GMO定量檢測等

相對定量研究：mRNA表達量分析，siRNA效果確認，差異顯示結果驗證等熒光定量PCR技術的應用第三十頁，共六十五頁，2022年，8月28日內容概要熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的原理熒光定量PCR解析方法SYBR法實驗流程及注意事項TIANGEN公司熒光定量產品選擇指南第三十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日絕對定量解析方法第三十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日Sample25絕對定量的定義

Log（起始濃度）與循環數呈線性關系，通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,即得到該擴增反應存在的線性關系

根據樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量第三十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日一個目的基因——即需要確定其量值的核酸序列。一組標準樣本——用來生成標準曲線。可以是含有目的基因的質粒、PCR產物、基因組DNA等。重復反應孔–——建議每個樣本使用三個或更多重復反應，以確保統計顯著性。標記方法的選擇——SYBRGreen法或探針法均可。實驗結果顯示——擴增曲線；標準曲線；融解曲線（探針法不需要）。絕對定量分析幾要素第三十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日質粒標準品的制備PCR目的基因克隆質粒提取，OD值定量，將質粒梯度稀釋作為標準品使用目的基因目的基因目的基因質粒目的基因基因組DNA第三十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日拷貝數的計算：待測樣本濃度（ng/ul）＝OD260×40×稀釋倍數樣本分子量=堿基數×324待測樣本拷貝數（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法：1v原液(標準品i)+9v稀釋緩沖液，得標準品ii1v標準品ii+9v稀釋緩沖液，得標準品iii1v標準品iii+9v稀釋緩沖液，得標準品iv1v標準品iv+9v稀釋緩沖液，得標準品v質粒標準品稀釋方法與拷貝數計算第三十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日方法：從血液中提取病毒DNA，以TaqMan探針法進行熒光定量檢測

試劑：TIANGEN公司探針法試劑RealMasterMix（Probe）（目錄號：FP203）

標準品：質粒標準品濃度為106、105、104、103；2個重復；設陰性空白對照

實驗步驟：提取HBVDNA；設計特異引物；設計TaqMan探針并標記探針；熒光定量擴增；結果分析：獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數。絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量第三十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD標準品5×10328.1828.6428.410.16標準品5×10425.2525.1425.190.04標準品5×10522.1122.4622.280.12標準品5×10618.6318.9218.770.10未知樣品?20.5620.4520.50.05空白對照NoneNone實驗數據絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量第三十八頁，共六十五頁，2022年，8月28日擴增效率（E）計算E=10-1/斜率

－1=10-1/-3.29

－1

=2.01－1=1.01標準曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標準曲線y=-3.29x+40.33R2=0.9978絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量相關系數（R2）：大于0.98，越接近1，結果可信度越高。擴增效率（E）：0.9-1.2,越接近1，越理想。第三十九頁，共六十五頁，2022年，8月28日未知樣品拷貝數的計算將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.29X+40.33QuantityUnknown=106.03

=1,071,519copies絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量X=20.5-40.33-3.29=6.03第四十頁，共六十五頁，2022年，8月28日相對定量解析方法第四十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日理論上目的基因表達量分析條件SampleBSampleA目的基因擴增效率相同RNA提取效率相同細胞起始數相同實際目的基因表達量分析相對定量的必要性第四十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日相對定量分析方法比較兩個或兩個以上樣本中某個基因表達量的變化！關注點：基因的相對表達量，而不是基因的絕對量！第四十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日一個參照樣本一個或一個以上的未知樣本一個目的基因管家基因——用來校對不同樣本之間目的基因的實際表達量重復反應孔–——建議每個樣本使用三個或更多重復反應，以確保統計顯著性。標記方法的選擇——SYBRGreen法或探針法均可。實驗結果顯示——擴增曲線；標準曲線（有些分析方法不需要）；融解曲線（探針法不需要）。一組標準樣本（有些分析方法不需要）相對定量分析幾要素第四十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日管家基因

維持細胞基本代謝活動所必須的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等篩選方法根據文獻提供通過具體實驗篩選相對定量分析——管家基因篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實驗組實驗值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

第四十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日雙標準曲線法

2-△△Ct法

相對定量分析——兩種常用的分析方法第四十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日

通過標準曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進行定量，然后根據計算公式求得相對值即為相對表達量。

相對值=校正值=目的基因定量結果管家基因定量結果待測樣品的校正值對照樣品的校正值相對定量分析——雙標準曲線法公式：第四十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日優點：分析簡單，實驗優化相對簡單缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標準曲線應用：基因表達調控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一相對定量分析——雙標準曲線法檢測樣品管家基因H目的基因X定量結果定量結果校正值相對量對照樣品6391.5343.40.05371.000待測樣品18589.717.30.00200.037待測樣品27432.91946.10.26184.874實驗數據第四十八頁，共六十五頁，2022年，8月28日相對定量分析——2法－△△CtXT是目標分子達到設定的閾值時的分子數RT是內參分子達到設定的閾值時的分子數

假設目標序列與內參序列擴增效率相同：

或最后用任一樣本q的XN除以參照因子（calibrator，cb）的XN得到：

對于一個少于150bp的擴增片斷而言，如果Mg2+濃度、引物都進行了適當的優化，擴增效率接近于1。因此目標序列的量通過內均一化處理之后相對于參照因子而言就是：

第四十九頁，共六十五頁，2022年，8月28日公式：F=2－相對定量分析——2法優點：無需作標準曲線缺點：假定擴增效率為100%；假定標準曲線及每次擴增之際間的效率都保持一致；實驗條件優化較為復雜。應用：基因表達調控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一待測組目的基因平均Ct值待測組內參基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組內參基因平均Ct值－－－－△△Ct第五十頁，共六十五頁，2022年，8月28日實驗數據：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-

△△Ct法：假設目的基因和參照基因擴增效率都接近100%△Ct（處理前）＝18－17＝1△Ct（處理后）＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct（處理后）－△Ct（處理前）＝－1.4－1＝－2.4比率（處理后/處理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4）=5.3所以Jun基因在處理后表達水平是處理前的5.3倍修正方法：如果我們知道目標基因和參照基因有相同的擴增效率，但擴增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正為：E－△△Ct，例如擴增效率為1.95，那么計算公式可修正為1.95－△△Ct相對定量分析——2-△△Ct法第五十一頁，共六十五頁，2022年，8月28日內容概要熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的原理熒光定量PCR解析方法SYBR法實驗流程及注意事項TIANGEN公司熒光定量產品選擇指南第五十二頁，共六十五頁，2022年，8月28日SYBR法實驗流程及注意事項樣品制備定量體系配備引物設計反應條件優化濃度確定技能要求環境要求誤差控制數據分析儀器介紹RT上機反應體系優化試劑選擇分析方法第五十三頁，共六十五頁，2022年，8月28日樣品制備環境要求定量體系配備數據分析RT上機濃度確定SYBR法實驗流程及注意事項無RNase環境使用無RNase耗材專用RNase-free工具純度高、完整性好的RNA分光光度計檢測電泳檢測第五十四頁，共六十五頁，2022年，8月28日RT反應體系優化試劑選擇樣品制備定量體系配備數據分析上機AMVM-MLVQuant下游反應數確定反轉錄體積引物的選擇高效、全長的cDNASYBR法實驗流程及注意事項第五十五頁，共六十五頁，2022年，8月28日定量體系配備引物設計濃度確定環境要求誤差控制RT樣品制備數據分析上機核酸制備區反應液制備區制作標準曲線設定濃度區間使用mix降低系統誤差設置重復（≥3次）設置空白和陰性對照均一的反應液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃單個堿基重復＜4個無二級結構擴增長度：100－200bp第五十六頁，共六十五頁，2022年，8月28日反應體系優化上機反應條件優化RT樣品制備模板準備數據分析退火溫度優化：梯度PCR延伸時間：產物長度決定反應體積＞5ul，推薦20－50ul引物濃度優化，模板量優化Mg2＋調節，酶活調節擴增效率：90％－110％重復性：std＜0.2標準曲線：R＞0.99或R2＞0.98SYBR法實驗流程及注意事項標準品待測樣本陽性對照陰性對照第五十七頁，共六十五頁，2022年，8月28日技能要求誤差控制儀器介紹上機試劑選擇RT樣品制備模板準備數據分析自配realmastermixRCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO