2/2對體外診斷試劑參考物質互換性的思考目錄TOC\o"1-1"\h\z\u第一篇互換性概念的“前世今生” 2第二篇互換性為什么很重要 8第三篇互換性仍然很重要 12第四篇互換性在計量溯源性中的演進作用 19第一篇互換性概念的“前世今生”新版ISO17511非常強調參考物質的互換性。一直以來，我對互換性的理解也是似是而非，有很多迷惑不解之處。最近這幾個月，我查閱了大量文獻，并一遍一遍地去閱讀、去學習、去體會，逐漸對互換性有了更深一層的認識。這個過程中，也體驗到了學習的樂趣以及享受過程之美，當突然理解一句話含義的時候，當一個觀點震驚到自己的時候，當金句在腦海里回味的時候，大師們的智言妙語真的可以讓人豁然開朗，刷新三觀！在此，我將自己的學習收獲分享給大家，希望能對同仁們有所幫助。這僅僅是本人對互換性的一得之見，不全面，也不一定完全正確，有不對的地方請大家指正出來,一同交流、共同提高。“互換性”這個概念最早提出是在上個世紀70年代，美國紐約州的公共衛生實驗室沃茲沃斯中心生物化學實驗室RobertRej教授團隊在進行臨床酶活性檢測中，發現一些商業質控品在不同方法學間的差異，與病人血清不一樣，因此于1973年首次提出“commutability”這一概念。RobertRej教授研究發現由于質控品中酶的來源、同分異構體、酶分子的完整性、溶液基質等因素（如表1所示）以及質控品制備中凍干、添加工藝的引入（如表2所示），會導致一些質控品與臨床樣品有差異。實驗室所用的檢測系統（方法）之間有差異，表現在所用底物及底物濃度、輔助因子、緩沖液體系、pH、溫度等不同，不同的樣品與這些檢測系統的反應行為“behave”就不一樣。圖1給出了一個解釋示例，圖1中左圖的箭頭表示測量條件的改變，對于測量條件的改變，每種質控品反應不一樣，質控品A代表的對測量條件改變不敏感，質控品B代表的是對測量條件適度敏感，質控品C代表的是對測量條件變化產生顯著變化。如果質控品B的“behave”與臨床樣本的“behave”一致的話，質控品B是可用的，質控品A和質控品C則不能用。如果質控品A用于室內質控，即使實驗室測量結果發生了偏移而質控品A也監控不出來，如果質控品C用于室間質評或能力驗證，則可能發生實驗室誤差小但被判為不合格。圖1不同質控品隨著測試條件變化而表現出不同反應的示例RobertRej教授認為質控品產生的這種誤差不同于“interference”（干擾），也不同于“matrixeffect”（基質效應），“interference”和“matrixeffect”這兩個術語不足以準確描述這種誤差。在臨床化學中，“interference”是指被測物濃度因樣品特性或其它成分的影響而出現的臨床顯著性偏差，這種影響可見于檢測系統的非特異性、指示反應響應不佳、被測物活性抑制等情況。“matrix”是指一個物質系統中除分析物之外的所有成分，“matrixeffect”是指除被測量以外的樣品特性對特定測量程序測定被測量以及測量值的影響。某個基質效應的明確原因即為一個干擾。于是RobertRej教授團隊引入了“commutability”這一術語來識別校準品、質控品的特性，以區分替代樣品和真實的患者樣品差異性。使用“commutability”是想要表達“exchangeable”、“convertible”這樣的意思。RobertRej教授最初使用“matrix-mimicofthespecimen”這個詞，后來也是經過相當困難的選擇之后才確定最終用“commutability”。曾經也有專家想用“representativeness”或者“fidelity”取代“commutability”，但最終沒有推行開。互換性意味著患者樣品在任何兩種分析程序之間的關系也適用于具備互換性的參考物質，參考物質在方法間的特性與真實臨床樣品方法間的特性具有可比性。盡管最初“commutability”是從臨床酶活性檢測中發現的，但逐漸地在其他臨床檢驗項目中也發現了類似問題。90年代開始臨床檢驗界逐漸接受了參考物質應具備“commutability”(互換性)這一屬性。1998年歐洲議會和理事會簽署了一項關于體外診斷器具的指令（Directives98/79/EC）,其中關鍵一條內容是要求體外診斷試劑的校準物和質控物定值應溯源到已有的高一級別的參考方法或參考物質。該指令推動了臨床檢驗計量溯源性的發展，為了配合該指令的執行，1999年歐盟制定了5個歐洲標準，這5個標準后來被ISO直接引用成為國際標準，這5個標準就是大名鼎鼎的ISO17511（關于醫學檢驗溯源）、ISO18153（關于臨床酶測定溯源）、ISO15193（對參考測量程序的要求）、ISO15194（對參考物質的要求）、ISO15195（對參考測量實驗室的要求）。其中，ISO15194（EN12287:1999）中對互換性進行了明確定義并對參考物質互換性提出了要求。ISO／IEC99：2007《國際計量學基本通用術語》(VIM)中第一次列出了“標準物質的互換性(commutability)”的定義：參考物質的特性，該特性通過由兩個給定測量程序得到的、對參考物質中某一規定量的測量結果以及對其他特定物質測量結果關系之間的接近程度來證明”。VIM中增加該術語，表明了其他領域也認識到了該問題。參考物質可互換的概念起源于臨床檢驗領域，但是參考物質的互換性絕不僅僅存在于該領域，只要存在被測量的定義、基質效應等問題，就會存在互換性問題，在農藥、獸藥殘留測定等其他領域，大家也逐漸認識到參考物質互換性的重要。RobertRej教授團隊對互換性研究了20多年，并首次創造了這個概念。又20多年過去了，行業還在對該問題繼續研究中，即使今天也沒有說研究特別透徹，這正是我們臨床檢驗和體外診斷的特殊性所在。第二篇互換性為什么很重要上一篇提到美國紐約州的公共衛生實驗室沃茲沃斯中心生物化學實驗室RobertRej教授團隊在進行臨床酶活性檢測中，發現一些商業質控品在不同方法學間的差異，與病人血清不一樣，因此于1973年首次提出“commutability”這一概念。隨后科學家們在其他臨床檢驗項目中也發現了類似問題，業界逐漸接受了參考物質應具備“commutability”(互換性)這一屬性。如今，過去了40多年，“commutability”的定義與當初相比也發生了一些擴展，隨著實踐工作的進展，大家對互換性的認識也逐漸加深。從這一篇，我將介紹另一個重要人物W.GregMiller教授，Miller教授是美國弗吉尼亞聯邦大學病理系主任，他是全球著名的標準化專家，一直致力推進醫學實驗室標準化和一致化。Miller教授發表了很多論文，特別是他陸續發表了三篇關于互換性的綜述文章，這三篇文章闡述“commutability”的演變與發展，對我理解“commutability”有很大幫助，在此分享給大家。本篇重點介紹Miller教授2006年在《ClinicalChemistry》上的題為“WhyCommutabilityMatters（互換性為什么很重要）”的文章。互換性與溯源性是緊密相連的。無論醫學實驗室使用什么檢測系統，病人樣品的結果應具有可比性，這是醫學實驗室的目標。要想實現這一目標，建立計量溯源性是一條有效的路徑，即常規的方法（檢測系統）盡可能溯源到現有的高級別的參考物質和參考方法。在醫學實驗室研究計量溯源性過程中，逐步發現參考物質互換性的重要。參考物質被用于建立或驗證計量溯源性，它有一個賦值，該值代表了對真實值的最佳估計，由參考測量程序賦值，或在沒有參考測量程序時由一致化程序確定該參考物質的濃度（或活性）。當某個參考物質用于常規方法時，必須在所有使用該參考物質的常規方法間確認其互換性，這樣就能確保當測量患者樣品時，無論實驗室使用何種常規方法，患者樣品的結果具有可比性。當某個參考物質的互換性沒有被確認，常規方法的結果就不能被合理地與參考物質的定值做比較，因為觀察到的偏倚可能是因為參考物質不具有互換性引起，也有可能是因為常規方法本身方法學特性差異導致。參考物質的不互換是由①基質效應和②被測量非天然分析物兩個原因引起。基質效應或基質偏倚是由參考物質與臨床樣品之間的樣品基質差異引起。樣品基質包括除分析物本身外的物質系統的所有組成部分。基質效應定義為樣品的一個性質對測量及測量結果有影響，與分析物的存在無關。另外分析物的非天然形式，如非人源的酶、非生理的分子的結合（如雙牛磺酸膽紅素），或對人來源分離出的蛋白復合物做了修飾，都可以產生與天然形式分析物不同的測量信號。要注意的是：任何分析方法都可能存在分析特異性的限制，尤其是對免疫分析，抗體特異性(例如，針對一個分析物的不同抗原表位)在不同的測量方法中可能不同。在進行參考物質互換性評價的時候，有的情況下，對臨床樣品缺乏特異性，是由于方法引起的，而不是參考物質不具備互換性。使用不具備互換性的參考物質校準常規測量程序，非但不能改善，反而可能導致這些測量程序測試臨床樣本時結果的一致性變得更差。因此這樣的參考物質，只能適用于校準等級中校準較高級別的方法（例如氣相色譜串聯質譜法、高效液相色譜法、原子吸收光譜法等參考方法），而不能直接校準常規方法。如果直接校準常規方法可能導致溯源是無效的，或者迫使制造商在其內部產品校準過程中增加額外的調整步驟，這些步驟在一定程度上增加了賦值的不確定度。我閱讀了Miller教授文章附的參考文獻，用這些參考文獻里面講到的實例來進一步闡明若使用不具備互換性的參考物質引起的后果。第一個例子是美國上個世紀90年代初開始的血脂測定標準化研究，VA、CAP和CDC幾個部門合作進行了一項研究，研究的目的是量化能力驗證用參考物質基質效應引起的偏差大小。結果顯示，有的實驗室在新鮮血清樣本中驗證了膽固醇測量的準確度，但對某些不具備互換性的PT樣本表現出顯著的基質效應偏差，具體如下表所示。第二個例子見美國NIST2000年主辦的關于臨床實驗室測量計量溯源性的研討會，多位參會專家的報告闡述由于校準等級中使用了不具備互換性的校準品而導致臨床實驗室測量結果不可比的實例。相關研究可見NISTIR6742《ProceedingsoftheWorkshoponMeasurementTraceabilityforClinicalLaboratoryTestingandInVitroDiagnosticTestSystems》。Miller教授的這篇文章就介紹到這兒，最后我們思考一下：為什么要要求互換性？哪些參考物質需要具備互換性？互換性怎么評價？第三篇互換性仍然很重要上一篇介紹了W.GregMiller教授2006年在《ClinicalChemistry》上的題為“WhyCommutabilityMatters（互換性為什么很重要）”的文章，這一篇介紹他2013年在《ClinicalChemistry》上發表的《CommutabilityStillMatters（互換性仍然很重要）》的文章。互換性是參考材料的一種屬性，對于相同的被測量，參考物質的值與具有代表性的臨床樣本的測量值在2個或更多測量程序之間具有相同的關系。對于哪些參考物質應要求具備互換性？一是當一個參考物質用作臨床實驗室常規測量程序的通用校準品時；二是用于外部質量評估(能力驗證)計劃，以評估測量程序之間的一致性時；三是體外診斷制造商用于給產品校準品賦值的參考物質。常規測量程序的產品校準品，如果溯源到一種不具備互換性的參考物質，可導致不同常規程序的患者樣本缺乏一致性。Miller提到了同期的《ClinicalChemistry》上IRMM(InstituteforReferenceMaterialsandMeasurements)的IngridZegers等人發表的題為《TheImportanceofCommutabilityofReferenceMaterialsUsedasCalibrators:TheExampleofCeruloplasmin（用作校準品的參考物質互換性的重要性：銅藍蛋白的示例）》的文章，在此也稍微介紹一下這篇文章。ERM-DA470是大家非常熟悉的參考物質，血清基質，含有15種血清蛋白的賦值，這15種蛋白也是從人血清中純化制備的。15種血清蛋白的賦值由歐洲、美國及日本共27家實驗室共同參與，定值雖然是常規方法（免疫透射比濁法、免疫散射比濁法、凝膠免疫擴散法），但操作程序和統計方法作了嚴格規定。作為一種復合的參考物質，DA470使用后顯著降低了實驗室間的檢測差異。1995年對法國眾多實驗室的研究表明，實驗室間的CV在使用統一的DA470校準后有了顯著提升，未使用前CV為10.0%～24.1%，使用后為5.8%～12.2%，且準確度也有明顯改善。在ERM-DA470快用完后，又推出了ERM-DA470k，將470的值傳遞給470k。但是，在標準化的過程中，發現470并未實現銅藍蛋白檢測的一致化，究其原因，是因為470中的銅藍蛋白不具有互換性造成的。因此，在470k中去掉了銅藍蛋白這一項的賦值。Zegers在《TheImportanceofCommutabilityofReferenceMaterialsUsedasCalibrators:TheExampleofCeruloplasmin（用作校準品的參考物質互換行的重要性：銅藍蛋的示例）》這篇文章中的主要研究結果如下：（1）方法學比較各種方法間的平均CV為１.7％～６.1％,方法學配對比較，采用Passing–Bablok回歸分析，Ｐearson相關系數ｒ均＞0.98，這說明不同方法間有很好的相關性。但是，方法學比對的斜率從0.56～1.42，這說明方法學間的差異比較大。（2）DA470的互換性在有些檢測系統如RocheIntegra、RocheHitachi、DakoHitachi和AU2700間的組合，470表現出互換性的，但是470在DakoHitachi與AbbottArchitect、Immage、BNProspectⅠ的組合卻缺乏了互換性。（3）英國NEQAS的結果Zegers也總結了英國室間質評結果，研究表明：對于新鮮樣品，方法學間有系統偏倚，比如BeckmanImmage系統測的值比較高，而Roche和Olympus系統測的值低（見下圖A）；對于加入疊氮化鈉后的EQAS樣品，不同方法的結果差異顯著降低，對于新鮮的EQAS樣品，方法間CV值在9%到25%之間，而對于含有疊氮化鈉的EQAS樣品，方法間CV值在1%到6%之間(見下圖B和C)，似乎對于這樣非新鮮的樣品，不同方法的結果更靠近；添加了Bronidox的EQAS樣品，顯示出非常相似的方法CVs(見下圖C)。在不同的存儲時間后，每種方法的平均值沒有顯著變化(見下圖D)。Zegers認為470的表現很類似Aged（非新鮮的）患者樣品，在Aged470作為新鮮EQAS樣品結果的溯源性基礎時，方法間的變異很高。但Aged470為Aged的EQAS樣品提供溯源性時，方法間變異非常小。事實上，制造商已經用該值轉換給自己試劑盒校準品，這樣造成了新鮮樣品的檢測系統間變異。但對儲存過的樣品進行銅藍蛋白的檢測時，儲存過樣品內銅藍蛋白的性質類似470，這樣檢測系統間變異非常低。所以，檢測系統間變異在很大程度上可以用470缺乏互換性來解釋。為何470的中的銅藍蛋白表現出Aged，可能是因為作為血清中輸送銅的蛋白，銅離子與蛋白結合數量不同造成CER以多種不同形式存在，其各種形式在血清中無法長期保持穩定，以及該蛋白對蛋白水解比較敏感等多種因素造成。下面回到Miller的這篇綜述，Miller認為所有擬用作通用校準品或用于外部質量評估/能力驗證一致性評價的參考物質，其提供者都應確保這些參考物質與具有代表性的臨床患者樣本具有互換性。從實際的角度來看，不可能對全世界使用的每一種測量程序都進行評估。一種合理的辦法是評價常用程序或方法。2010年CLSI也發布了互換性評價的標準EP30-A《Characterizationandqualificationofcommutablereferencematerialsforlaboratorymedicine:approvedguideline》。Miller也指出，對于那些不太常用的測量程序，或者新進入市場的產品，以及實驗室自建方法，則這些方法（產品）的開發者如果想要使用該參考物質，則由他們自己來評價該參考物質的互換性和適用性。研制具有互換性的參考物質還是具有較大的技術挑戰和難度，因為對于某些給定的分析物，其在人體內的分子形式不能被很好地被定義，或者會隨著臨床狀態不同而發生變化。此外，可能難以獲得足夠的生物材料，其中包含測量的適當分子形式，并從中制備參考材料。還有就是，在臨床樣品處理過程中，分子形態的改變、感興趣的生物標記物的純化以及在制備時添加穩定劑時，通常會改變樣品基質，這些因素也對參考物質的互換性提出了挑戰。純品形式的生物標記物可能不足以制備用于常規測量程序的參考物質，例如，如果用重組蛋白替代，但可能沒有適當的翻譯后糖基化或分子復合體結構來充分代表被測量。盡管存在這些技術挑戰，互換性仍然是用于參考物質的基本要求。Miller教授的這篇文章就介紹到這兒，最后我們還是要回到這三個問題：為什么要要求互換性？哪些參考物質需要具備互換性？互換性怎么評價？第四篇互換性在計量溯源性中的演進作用這一篇繼續介紹W.GregMiller教授2021年在《ClinicaChimicaActa》發表的《Theevolvingroleofcommutabilityinmetrologicaltraceability（互換性對計量溯源性不斷發展的作用）》。這篇文章非常重要，Miller對互換性的發展做了一個全面的分析總結，下面我將文中的主要觀點列出來。1、背景互換性是參考物質(RM)的一種特性，它表示RM對測量程序(MPs)的分析響應，與臨床樣品相同。在圖1中，具有互換性的RM(綠色)與臨床樣本具有相同的響應，即在可接受的標準內，兩種不同的MPs測量臨床樣品與測量RM，在偏倚上沒有差異。不具有互換性的RM(紅色)與臨床樣品觀察到的反應不同，表現為偏倚有差異。當RM(藍色)偏倚的不確定度與可接受標準重疊時，將會無法得出互換性的結論。幾十年來，測量程序測量結果的標準化一直是臨床實驗室的重要目標，用于測量程序標準化的校準參照的參考物質應具備互換性，這一要求現在已得到一致認同。2、計量溯源性中的互換性新版ISO17511描述了臨床實驗室檢驗結果的計量溯源。如圖2所示：互換性不適用于一級純物質的RM(m.1)，但可適用于m.2位置的一級校準品，這取決于p.3位置的參考測量程序的分析選擇性。在本報告中，我們關注位置m.3的二次校準品，它應是一個具有互換性的基體參考物質，用于校準制造商選定的測量程序（p.4）。p.4和p.5中使用的MPs是IVD生產制造過程的一部分，用于為位于位置m.5的終端用戶校準品賦值，而該校準品又用于校準最終用戶的測量程序（p.6）。p.4和p.5所使用的MPs通常與p.6所使用的最終用戶MP相同，但更為嚴格進行校準和精密度測量，以減少結果的不確定度。RM的互換性主要取決于試劑配方以及其他測量參數。因此，m.3的基體參考物質必須與最終用戶使用的測量程序（p.6）所測量的臨床樣本可互換。如果m.3位置的基體參考物質與臨床樣本不互換，那么校準等級將引入一個偏倚，導致m.6位置的臨床樣本結果不正確，且不能適當溯源到m.1位置的一級參考物質。m.4位置的制造商工作校準品和m.5位置的終端用戶校準品在校準等級中用于特定的某個IVD制造商測量程序，即是專用的，不是共用的，因此不要求必須具備互換性，m.4和m.5的賦值可以通過一個已知的、恒定的互換性偏倚予以糾正，當然這種工作校準品或終端用戶校準品不能用于校準其他IVD試劑。3、現有參考物質普遍缺乏充分的互換性確認在2000年，由美國國家標準與技術研究所(NIST)舉辦的關于臨床實驗室溯源性的研討會上，大家高度關注多個案例，這些案例各種測量的不充分直接或間接地與在校準等級中使用的參考物質不具備互換性有關。“互換性”一詞在這次NIST研討會的會議記錄中出現了50多次。在20世紀80年代和90年代初，多個報告強調了血清膽固醇的不同臨床實驗室MPs的標準化進展，當時的實驗室受益于新開發的國家膽固醇參考系統，該系統包括高等級的RM和參考測量程序。然而，關于血清膽固醇的校準等級的現狀仍然存在問題，特別是仍然缺乏能夠傳遞正確度的、具有互換性、基體二級參考物質。圖3示意了不具備互換性的RM如何將偏差引入臨床實驗室最終用戶MP。除了基質的影響，互換性還受到實際所測量的分子形式的影響。例如ERM-DA470k/IFCC中的c反應蛋白不具備互換性。c反應蛋白在天然樣品中是五聚體，而470k在凍干過程中會引起五聚體的解離成單體亞基。免疫測定針對的是五聚體，而質譜測的是五聚體或單體消化而成的肽段，這樣，免疫分析方法和質譜方法中對470k就有不同的測量反應。新的參考物質ERM-DA474/IFCC為冰凍人血清，解決了上述問題，具有很好的互換性。4、具備互換性的CRM，超出預期用途使用或稀釋使用時應重新進行互換性評估舉例，ERM-DA470k/IFCC的各種血清蛋白，如果用戶決定使用這個參考物質對除血清以外的其他體液（例如尿液、腦脊液）的測量程序進行校準，例如對尿白蛋白的測量程序進行校準，則用戶有義務驗證該材料在新測量系統中的互換性。這一原則適用于任何偏離參考物質提供者使用說明的情況，如用戶對參考物質進行進一步稀釋。5、在多個測量程序間具備互換性是一個有用的參考物質的先決條件IFCC最近描述了兩種評估參考物質在多個測量程序間互換性的方法。對于這兩種方法，MPs都必須具有足夠的精密度和選擇性，以能準確測量RM和CSs（clinicalsamples）之間的互換性偏差（commutabilitybias）。第一種方法見IFCCWorkingGroupRecommendationsforAssessingCommutabilityPart2:UsingtheDifferenceinBiasBetweenaReferenceMaterialandClinicalSamples,Clin.Chem.64(2018)，這種方法對MPs進行一對一比較研究，在每對比較中，每個RM的互換性都是獨立評估的。第二種方法見IFCCWorkingGroupRecommendationsforAssessingCommutabilityPart3:UsingtheCalibrationEffectivenessofaReferenceMaterial,Clin.Chem.64(2018)。參考物質用于校準每一個MP，然后測試CSs（clinicalsamples），臨床樣本結果在所有MP之間進行比較。如果RM具有互換性，則所有MPs的臨床樣本結果將相似，若RM不互換，則某個或某些MP將產生與其他MP明顯不同的臨床樣本結果，當然這取決于預先設定的可接受標準。這兩種方法各有其優先使用范圍，如果想要評價一個RM的互換性偏差（commutabilitybi