第11章基因組的復制1原核生物基因組的復制2真核生物核基因組的復制3細胞器基因組的復制5復制的調控

DNA復制的起始1)復制子—復制的單位2)復制起始點3)DNA雙鏈的解旋4)復制起始復合物的組裝5)復制起始與終止大腸桿菌DNA復制酶DNA聚合酶I是大腸桿菌DNA復制中主要的酶,具有校讀功能.DNA

聚合酶I的校讀功能DNA聚合酶I復合物具有兩種生化功能：催化核苷酸聚合反應和執行3＇→5＇的核苷酸切除（a）。DNA復制時，如果環境中存在稀有互變異構體堿基，有時會將其錯誤摻入（a）進入延伸的DNA新鏈（b）。圖中所示為烯醇鳥嘌呤異構體（G）被選擇與胸腺嘧啶T配對。但DNA聚合酶I在進入下一個堿基聚合反應時，由于錯誤摻入的堿基很快回復到正常構型，DNA聚合酶I會馬上覺察這種錯誤，主動往后滑移，并利用其校讀功能區將錯誤配對的堿基切除（d）。將錯誤配對堿基切除后，DNA聚合酶I會重新挑選正確的堿基成員繼續合成新鏈（e）。DNA復制時先導鏈和后隨鏈同向而行圖中所示為大腸桿菌T7噬菌體復制叉上前導連和后隨鏈并列復制的裝置。復制體中有一個硫氧還蛋白trx可在解旋酶和引物酶組成的6聚體兩側分別與6聚體亞基和DNA聚合酶結合，從而將前導連和后隨鏈的DNA聚合酶同向設置，協同前移。gp2.5:ssDNAbindingprotein，DNA單鏈結合蛋白.gp4:phage-encodedhelicase/primase，解旋酶/引物酶6聚體.gp5:T7DNApolymerase，DNA聚合酶.trx:processivityfactor,Escherichiacoli

thioredoxin，大腸桿菌持續和成因子硫氧還蛋白（引自Hamdan

SM等，2005）。DNA復制單位--復制子復制子（replicon）是DNA的復制單位,由復制起始點,復制順序和復制終點組成.1）大腸桿菌染色體為一個復制子；2）啤酒酵母基因組約有300個復制起始點,每

40kbDNA組成一個復制子；3）人類基因組有20,000個復制起始點,每150kb一個復制子。復制起始點--origin所有DNA的復制都在復制起始點開始,復制的調控都集中在起始點,中心事件是復制起始復合物的組裝與復制的“點火”.

細菌與酵母復制起始點的分離將大腸桿菌質粒復制起始點切除,然后用相同的限制酶處理染色體DNA.將缺少復制起始點的載體DNA與染色體片段連接轉化,陽性克隆即含有復制起始點.大腸桿菌oriC的結構與功能DnaA蛋白與OriC位置的9bp重復順序結合,并以消耗ATP的形式彎曲DNA.彎曲DNA產生的扭曲力促使富含AT的13bp重復順序解鏈.暴露的單鏈DNA與SSB(單鏈結合蛋白)結合,形成復制泡.DNA復制時解旋單鏈的維持復制速率1)原核生物DNA復制速率約500bp/s;2)真核生物DNA復制速率約40-50bp/s.真核生物DNA復制速率約為原核生物DNA復制速率的1/10.大腸桿菌基因組復制起始位點與終止位點大腸桿菌染色體復制終止與分離大腸桿菌DNA復制的終止細菌質粒復制拷貝數的調控1)細菌質粒的拷貝數有兩種:單拷貝,多拷貝.2)細菌質粒的復制利用的裝置與染色體DNA的復制是相同的,但質粒的復制獨立于染色體..3)細菌質粒拷貝的控制有相對獨立的調控機制.4)質粒的非兼容性調控與拷貝數調控有兩種不同的機制:反義RNA和重復子(iteron).5)染色體DNA復制是雙向復制,質粒DNA復制是單向復制.反義RNA

調控質粒復制大腸桿菌ColE1質粒利用復制起始點上游的P-II啟動子轉錄起始復制.P-I啟動子可轉錄反義RNAI.反義RNAI可與RNAII形成雙鏈,阻止RNAII高級結構產生,抑制復制起始.F質粒單拷貝復制調控DnaAbox:DnaA蛋白結合區.A/T:富A/T區.13mer:OriC區13bp同源序列.DR:順式重復順序,與repE蛋白結合,使雙鏈DNA分開.IR:反向重復順序,順序與DR一致.incC:拷貝數控制區.ori2:質粒復制起始點.sopA,B,C:參與質粒分配到子細胞.P/O:啟動子/操縱基因.repE為復制蛋白,單體時可與DR重復順序結合起始復制.repE在二聚體時與IR結合,抑制復制起始和轉錄.F質粒復制拷貝的自主調控

F質粒單拷貝調控的兩種模型:A,重復子模型;B,手拷模型.A.自然狀態下RepE蛋白質趨向形成二聚體.在Rep基因轉錄合成RepE蛋白質的早期,主要是單體狀態.隨著RepE蛋白質的增加,二聚體RepE出現,并在復制起始點下游與DNA結合,阻止復制叉前進.B.ori2和inC共同調控F質粒的復制,維持單拷貝或低拷貝數,handcuffing

酵母基因組復制起始點-ARS1)酵母復制起始點又稱為ARS(autonomouslyreplicationsequence).2)酵母復制起始點含4個亞功能區:A和B1:ORC(OriginRecognitionComplex,起始識

別復合物)識別順序(originrecognitionsequence),為復制調控區.B2:與大腸桿菌oriC中的13bp類似,起始解鏈區.B3:ABF1因子結合位置,產生扭曲力,促使B2解鏈.

酵母ARS的功能Adomain(coreconsensus)ORCTranscriptionfactorABF1enhancesinitiation-促使解鏈BdomainsimperfectconsensusB2-解鏈區B1B3ORC與MCM的關系ARS:autonomouslyreplicationsequence,酵母的ARS含有11bp的保守順序,即ACS(ARSconsensussequence).ORC:Aproteincomplex,consistingofsixsubunits,servesasaeukaryoticDNA-synthesisinitiationfactor:theOriginRecognitionComplex(ORC).ORCbindstoACSinanenergydependentmanner.GeneticstudieshaveshowthattheORCisrequiredforDNAreplication.MCM:Minichromosomemaintenanceproteins(MCMs),可在ORC的作用下進入復制起始點,與

DNA雙鏈的解旋有關.MCM促使DNA雙鏈退旋MCM在DNA復制場聚集高等生物復制起始點1）哺乳動物基因組也有復制起始點，但不能在大腸桿菌中起始復制，組成細節不明；2）已經分離到玉米基因組復制起始點，可在大腸桿菌中起始復制，結構類似低等生物ARS。3)迄今為止尚未從高等真核生物中分離到結構清楚,功能明確的復制起始點.真核生物DNA多聚酶

成員 外切核酸活性功能

3’→5’(校讀)5’→3’——————————————————————————————————DNA多聚酶α－－合成引物（RNA和DNA）

DNA多聚酶β－－DNA修復

DNA多聚酶γ

+？線粒體DNA復制

DNA多聚酶δ+

－主要復制酶

DNA多聚酶ε+？DNA復制，確切功能不明—————————————————————————————————真核生物DNA多聚酶

成員 外切核酸活性功能

3’→5’(校讀)5’→3’——————————————————————————————————DNA多聚酶α－－合成引物（RNA和DNA）

DNA多聚酶β－－DNA修復

DNA多聚酶γ

+？線粒體DNA復制

DNA多聚酶δ+

－主要復制酶

DNA多聚酶ε+？DNA復制，確切功能不明—————————————————————————————————

真核生物DNA復制延伸

真核生物DNA復制涉及三個酶:1)DNA聚合酶α,引物合成;2)DNA聚合酶δ,復制DNA單鏈;3)FEN-1,具RNA酶活性,切除引物.岡畸片段復制1）細菌中岡畸片段長度在10002000核苷酸之間。2）真核生物中，岡畸片段要短得多，少于200個核苷酸。這一點很有意義，因為其長度與纏繞核小體和連接核小體間區的DNA長度大致相同，可能每一輪岡畸片段的合成均以核小體為單位（核小體纏繞DNA長140150bp，連接核心顆粒的DNA長度5070bp）。后隨鏈岡崎片段引物的切除機制1）引物酶（DNA多聚酶-α，Pol-α）合成岡崎片段引物；2）復制因子RFC取代引物酶，征調PCNA；3）DNA多聚酶Pol-δ延伸新合成鏈；4）DNA多聚酶Pol-δ遇到前面的岡崎片段復制引物將其側移；5）flap內切核酸酶Fen1將RNA引物切離；6）DNA多聚酶Pol-δ繼續延伸合成，兩段新合成的岡崎片段之間的缺口由DNA連接酶1（Lig1）縫合。很少知道真核生物復制終止的事件1）真核生物中與細菌類似的終止順序以及Tus蛋白迄今尚未分離到，很有可能真核的復制叉是隨機相遇的。2）真核生物的復制復合物是不解體的，因為復制場是細胞核中持久的結構成分。3）有一個更加困難的問題是，真核細胞核中合成的子鏈分子如何解決相互纏繞的問題。一般認為纏繞的DNA分子可能保持在很小的范圍內，采取斷裂重接方式回歸原位。有人設想，每個復制場都只復制單個DNA，使子鏈分子有序排列而不至于彼此糾纏，但這些猜測還缺少證據。端粒復制的問題1)

延滯鏈3‘端最外側的順序無法拷貝，因為最后一段岡畸片段不能合成引物，其引物的位點按規律應在模板鏈之外。末端岡畸片段的丟失意味著延滯鏈的拷貝要比模板鏈短一些。當它們作為親代模板進行下一輪復制時，子鏈分子就會比祖代鏈在端部缺失一段順序。2）引導鏈也有第一個起始RNA引物如何除去的問題，因為采取標準的方法切除已有的RNA引物必須在5’-方向有一段岡畸片段存在，而這實際上是沒有的。即使末端RNA引物保留的到下一輪復制也不能作為DNA多聚酶復制的模板，因此末端RNA引物同樣造成復制的子鏈5'端缺失。端粒DNA復制的問題（圖解）

端粒DNA的分離策略

酵母染色體端粒的分離

端粒DNA的順序組成不同真核生物染色體端粒的組成：

物種端粒重復順序端粒酶RNA模板順序——————————————————————————------------

人類5’-TTAGGG-3’5’-CTAACCCTAAC-3’

四膜蟲5’-TTTTGGGG-3’5’-CAAAACCCCCAAAACC-3’Oxytricha5’-TTGGGG-3’5’-CAACCCCAA-3’

端粒復制端粒酶是一個逆轉錄酶端粒酶是由RNA與逆轉錄酶組成的復合物,具有類似HIV逆轉錄酶的掌形結構.母指與掌指可閱讀模板順序,活性位置位于掌心.端粒復制端粒末端重復順序長度的控制1)端粒的長度由端粒結合蛋白（telomerebindingprotein，TBP）調控，防止端粒過分延伸.2)端粒DNA的富G鏈末端的單鏈突出極易受到傷害，細胞必需尋找某種方式保護游離的單鏈。富G鏈末端實際上形成特別的t-環結構(telomereloop,t-loop)人類細胞中有兩種蛋白質（TRF1和TRF2）負責t環的形成。TRF1的功能在于同末端DNA結合使其彎曲并改變DNA的構型，TRF2與其它蛋白一道促使突出的單鏈侵入端粒雙鏈重復順序內部形成取代的D環(D-loop).D環的形成提供了一個有序的高極結構，使突出3'單鏈埋藏在DNA分子內部免于同端粒酶接觸，同時起到保護單鏈的作用。現已證實這種t-環結構普遍存在，單細胞原生生物的染色體末端也采取t-環策略。端粒DNA3’

突出單鏈的結構端粒與壽命

人類線粒體基因組的復制

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單向復制人類線粒體基因組為雙鏈環狀DNA，外圈為重鏈（H），內圈為輕鏈（L）。復制重鏈時在復制起始點OH以輕鏈為模板轉錄合成一段RNA，隨后該RNA分子由RNaseH在OH位點切割作為引物，并由Pol合成新鏈。當Pol合成的新鏈到達OL位置時，引物酶在此合成一段RNA引物并由Pol拷貝新.OH,重鏈復制起始點；OL,輕鏈復制起始點；mtSSB,動線粒體單鏈DNA結合蛋白.酵母

線粒體DNA

的復制

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D-環復制酵母線粒體復制模型:A)復制起始點由三個GC簇,A,B和C區組成,γ鏈含啟動子γ.B)RNA多聚酶利用啟動子γ合成一段RNA,經RNaseH切割形成引物.同時在非γ鏈位于啟動子γ上游的位置由引物酶合成另一個引物.C)sc-Mip1p(Polyγ同源蛋白)利用引物延伸新鏈.Rpo41p,RNA多聚酶催化亞基;mtTFB,RNA多聚酶輔助因子;Rim1p,單鏈DNA結合蛋白.

真核生物DNA復制的控制1)真核生物核基因組每次細胞分裂只能復制一次.2)真核生物核基因組復制次數的控制與復制資格因子有關.復制與細胞周期調控資格因子與基因組復制的調控

在有絲分裂結束和G1期起始時，Gem蛋白降解釋放Cdt1,隨后Cdt1和Cdc6蛋白聯手征調MCM2-7蛋白轉移到復制起始點（ORI）與ORC結合,組成前復制復合物（pre-RC）。隨后CDK和DDK(Cdc7/Dbf4激酶)征調Cdc45和GINS與MCM2-7結合形成前起始復制復合物（pe-IC），標志細胞周期S期確立。在Cdc45和GINS的協助下，MCM2-7將DNA雙螺旋解旋，隨之安裝復制裝置，起始DNA復制。當MCM2-7離開復制起始點后，前