1/1生物工業分析實驗講義1實驗一、滴定法測定酸奶總酸度

生物樣品中的酸味物質，主要是溶于水的一些有機酸和無機酸。在果蔬及其制品中，以蘋果酸，檸檬酸，酒石酸，琥珀酸和醋酸為主；在肉，魚類樣品中則以乳酸為例。此外，還有一些無機酸，像鹽酸，磷酸等。這些酸味物質，有的是樣品中的天然成分，像葡萄中的酒石酸，蘋果中的蘋果酸；有的是人為的加進去的，像配制型飲料中加入的檸檬酸；還有的是在發酵中產生的，像酸牛奶中的乳酸。酸在生物樣品中主要有以下三個方面的作用。

1、顯味劑

不論是哪種途徑得到的酸味物質，都是生物樣品重要的顯味劑，對生物樣品的風味有很大的影響。其中大多數的有機酸具有很濃的水果香味，能刺激食欲，促進消化，有機酸在維持人體體液酸堿平衡方面起著重要的作用。

2、保持顏色穩定

生物樣品中的酸味物質的存在，即pH值的高低，對保持生物樣品的顏色的穩定性，也起著一定的作用。在水果加工過程中，如果加酸降低介質的pH值，可抑制水果的酶促褐度；選用pH6.5-7.2的沸水熱燙蔬菜，能很好地保持綠色蔬菜特有的鮮綠色。

3、防腐作用

酸味物質在生物樣品中還能起到一定的防腐作用。當生物樣品的pH小于2.5時，一般除霉菌外，大部分微生物的生長都受到了抑制；若將醋酸的濃度控制在6%時，可有效地抑制腐敗菌的生長。一、實驗意義與目的

酸度測定的意義

1.測定酸度可判斷果蔬的成熟程度

果品、蔬菜在其生長發育過程中，有機酸的種類和含量是在不斷變化的，通過測定酸的種類或含量能夠判別果蔬的成熟度。例如：如果測定出葡萄所含的有機酸中蘋果酸高于酒石酸時，說明葡萄還

未成熟，因為成熟的葡萄含大量的酒石酸。另外，不同種類的水果和蔬菜，酸的含量因成熟度、生長條件而異，一般成熟度越高，酸的含量越低。如番茄在成熟過程中，總酸度從綠熟期的0.94%下降到完熟期的0.64%，同時糖的含量增加，糖酸比增大，具有良好的口感，故對酸度的測定是判斷原料的成熟度的主要指標之一。

2.可判斷生物樣品的新鮮程度

原料的酸度常常是其新鮮的指標。例如：新鮮牛奶中的乳酸含量過高，說明牛奶已腐敗變質；水果制品中有游離的半乳糖醛酸，說明受到霉爛水果的污染。因此酸度的測定是檢測新鮮的指標之一。

3.可反映了生物樣品的質量

生物樣品中有機酸含量的多少，直接影響生物樣品的風味、色澤、穩定性和品質的高低。酸的測定對微生物發酵過程具有一定的指導意義。如：酒和酒精生產中，對麥芽汁、發酵液、酒曲等的酸度都有一定的要求。發酵制品中的酒、啤酒及醬油、食醋等中的酸也是一個重要的質量指標。

另外，酸在維持人體體液的酸堿平衡方面起著顯著地作用。人體體液pH值為7.3-7.4，如果體液的pH值過大，就要抽筋，過小則又會發生酸性中毒。

生物樣品中的酸度通常用總酸度（滴定酸度）、有效酸度、揮發酸度來表示。

總酸度：是指生物樣品中所有酸性物質的總量，包括已離解的酸濃度和未離解的酸濃度，采用標準堿液來滴定，并以樣品中主要代表酸的百分含量表示。

有效酸度：指樣品中呈離子狀態的氫離子的濃度（嚴格地講是活度）用pH計進行測定，用pH值表示。

揮發性酸度：指生物樣品中易揮發部分的有機酸。如乙酸、甲酸等，可用直接或間接法進行測定。

本實驗的目的：學會用滴定法測定生物樣品的總酸度。

二、原理

生物樣品中的有機酸（弱酸）用標準堿液滴定時，被中和生成鹽類。用酚酞作指示劑，當滴定到終點（pH=8.2，指示劑顯紅色）時，根據消耗的標準堿液體積，計算出樣品總酸的含量。其反應式如下：

RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O

三、試劑

0.1mol/L氫氧化鈉，0.5%酚酞指示劑

四、實驗步驟

1.0.1mol/L氫氧化鈉的標定：

稱取0.3-0.4g（0.0001g）干燥衡重后的基準物鄰苯二甲酸氫鉀，加25ml水震蕩溶解，加2-3滴酚酞指示劑，用待標定的0.1mol/L氫氧化鈉滴定至溶液呈微紅色，15S不退色，平行兩次，同時做空白實驗，記錄用量。

2.酸奶樣品的測定：

稱取5g（0.01g）的酸奶于250ml的錐形瓶中，加20ml蒸餾水充分溶解搖勻，加2-3滴酚酞指示劑，用已標定的0.1mol/L氫氧化鈉溶液滴定樣品至微紅色15S不退色，即為終點。

3.計算

總酸度（%）=

式中：C：標準氫氧化鈉溶液的濃度mol/L為

V：滴定所消耗標準堿液的體積ml

V2：標定NaOH所消耗堿液的平均體積ml

M：樣品質量或體積（g或ml）

100

?mCVK

1000

2.2042??VW

W：所稱的基準物的質量（g）

K：換算為適當酸的系數，0.09,即1mmol氫氧化鈉相當于乳酸的克數是0.09克。

因為生物樣品中含有多種有機酸，總酸度測定結果通常以樣品含量最多的那種酸表示。例如一般分析葡萄及其制品時，用酒石酸表示，其K=0.075；測柑橘類果實及其制品時，用檸檬酸表示，其K=0.064；分析蘋果及其制品時，用蘋果酸表示，其K=0.067；分析乳品、肉類、水產品及其制品時，用乳酸表示，其K=0.090；分析酒類、調味品，用乙酸表示，K=0.060。

五思考題

1.簡述生物樣品中有機酸的種類及其特點，對于顏色較深的一些樣品，在測定其酸度時，如何排除干擾，以保證測定的準確度？

2.生物樣品的總酸度，有效酸度，揮發酸測定值之間有什么關系？生物樣品中酸度的測定有何意義？

實驗二、土豆中的淀粉含量的測定

土豆，學名馬鈴薯，俗稱“地蛋”、“山藥蛋”，系多年生地下莖草本作物，現多為一年一季或一年兩季栽培。除了食用之外，大多數的土豆可以做淀粉、酒精等工業原料。鮮馬鈴薯中的成分除了淀粉、水之外，還有1.8-8.5%的粗蛋白質和少量的纖維素和可溶性的糖。

一、目的要求

掌握還原糖直接測定原理、方法；

了解淀粉酸水解方法。

二、原理

首先將淀粉水解成葡萄糖。

測定總糖通常以還原糖的測定法為基礎，將生物樣品中的非還原性雙糖，經酸水解成還原性單糖，再按還原糖測定法測定，測出以轉化糖計的總糖量。

其次標定葡萄糖的含量，之后換算成淀粉地含量。

葡萄糖的標定原理如下：將一定量的堿性酒石酸銅甲、乙液等量混合，立即生成天藍色的氫氧化銅沉淀，這種沉淀很快與酒石酸鉀鈉反應，生成深藍色的可溶性酒石酸鉀鈉銅絡合物。在加熱條件下，以次甲基藍作為指示劑，用樣液滴定，樣液中的還原糖與酒石酸鉀鈉銅反應，生成紅色的氧化亞銅沉淀，待二價銅全部被還原后，稍過量的還原糖把次甲基藍還原，溶液由藍色變為無色，即為滴定終點。根據樣液消耗量可計算還原糖含量。另外，斐林試劑中加入亞鐵氰化鉀(黃血鹽)，使紅色氧化亞銅沉淀生成可溶性的復鹽，反應終點更為明顯。

Cu

2O+K

4

Fe(CN)

6

+H

2

O=K

2

Cu

2

Fe(CN)

6

+2KOH(淡黃色)

三、試劑

1．堿性酒石酸銅甲液：稱取15g硫酸銅及0.05g四甲基藍，溶于水中并稀釋到1000ml

2．堿性酒石酸銅乙液:取50g酒石酸鉀鈉及75g氫氧化鈉，溶于水中，在加4g亞鐵氰化鉀，完全溶解后，再用水稀到1000ml，儲存于橡膠塞玻璃瓶內。

3．106g/L亞鐵氰化鉀溶液。

4．鹽酸。

5．葡萄糖標準液：準確稱取1.000g干燥至恒量的純葡萄糖，加水溶解后加入5ml鹽酸，并以水稀釋至1000ml。

四、測定步驟

1、樣品處理：

①精稱0.2-0.4g（0.0001g）樣品，用30ml85%乙醇分三次洗滌過濾，棄濾液以除去可溶性的糖和蛋白，將殘渣用100ml水三次轉移至磨口三角瓶中，并加入6M鹽酸15ml。

②淀粉酸解為葡萄糖：樣品煮沸回流加熱1h，冷卻后加2滴甲基紅指示劑，用40%（質量分數）氫氧化鈉中和至黃色，再用鹽酸調制紅，改用10%的氫氧化鈉調至黃色，加水定容250ml，混勻，用干燥濾紙過濾，棄初濾液，收集濾液備用。

2、堿性酒石酸銅溶液的標定

①準確吸取堿性酒石酸銅甲液和乙液各5ml，置于250ml錐形瓶中，加水10ml，加玻璃珠3粒。

②從滴定管滴加9ml葡萄糖標準溶液，加熱使其在2分鐘內沸騰，并以每2秒一滴的速度滴加葡萄糖標準溶液，直至溶液藍色剛好褪去為終點。記錄消耗葡萄糖標準溶液的總體積。平行操作3次，取其平均值。

F=c×V

式中：F10mg堿性酒石酸銅溶液相當于葡萄糖的質量，mg;

C葡萄糖標準溶液的濃度，mg/ml；

標定時消耗葡萄糖標準溶液的總體積，ml。

V

3、樣品溶液預測

吸取堿性酒石酸銅甲液及乙液各5ml，置于250ml錐形瓶中，加水10ml，加玻璃珠3粒。加熱使其在2分鐘內沸騰，以先快后慢的速度從滴定管中滴加樣品液，須始終保持溶液的沸騰狀態，待溶液藍色變淺時，再以每2秒一滴的速度滴定，直至溶液藍色剛好褪去為終點。記錄消耗溶液的體積。

4、樣品溶液測定

吸取堿性酒石酸銅甲液和乙液各5ml，置于250ml錐形瓶中，加水10ml，加玻璃珠3粒。從滴定管加入比預測時樣品溶液消耗總體積少1ml的樣品液，使其在2分鐘內加熱至沸，以每2秒一滴的速度繼續滴定，直至藍色剛好褪去為終點。記錄消耗樣品液的體積。平行操作3次，取其平均值

五、結果計算

土豆中的淀粉含量（以葡萄糖計%）

式中：m樣品質量,g；

F10ml堿性酒石酸銅溶液相當于葡萄糖的質量，mg；

V測定時平均消耗樣品溶液的體積，ml；

250樣品溶液的總體積,ml。

0.9由葡萄糖換算成淀粉的系數

(C6H10O5)n+nH2O→nC6H12O6

淀粉葡萄糖

n162gn180g

162/180=0.9

即1g轉化糖量相當于0.90g淀粉

0.2土豆中的淀粉含量

100

10002509.02.0?????V

mF

六、討論和說明

此法所用的氧化劑堿性酒石酸銅的氧化能力較強，醛糖和酮糖都可被氧化，所以測得的是總還原糖量。

次甲基藍也是一種氧化劑，但在測定條件下氧化能力比Cu2+弱，故還原糖先與Cu2+反應，Cu2+完全反應后，稍過量的還原糖才與次甲基藍指示劑反應，使之由藍色變為無色，指示到達終點。

堿性酒石酸銅甲液和乙液應分別貯存，用時才混合，否則酒石酸鉀鈉銅絡合物長期在堿性條件下會慢慢分解析出氧化亞銅沉淀，使試劑有效濃度降低。

七、思考題

1滴定必須在沸騰條件下進行，保持反應液沸騰可防止空氣進入，避免次甲基藍和氧化亞銅被氧化而增加耗糖量。

2影響測定結果的主要操作因素。

實驗三、凱氏（Kjeldahl）定氮法測定面粉中的蛋白質

蛋白質是重要的營養素之一。蛋白質的測定方法很多，如總氮量法，福林—酚試劑法，雙縮脲法，紫外吸收法等。近來已有專用的蛋白質分析儀，但經典的凱氏定氮法仍是生物樣品，飼料分析，種子鑒定及營養和生化研究中最廣泛應用且具有足夠精度的方法。

一、目的

1、學習微量凱氏定氮法的原理

2、掌握凱氏定氮法的操作技術，包括未知樣品的消化、蒸餾、滴定及其含氮量的計算等。

二、原理

凱氏定氮法是一種經驗性的測定樣品蛋白質含量的方法，基本原理為根據氮元素在氨基酸中的平均比例，通過測定樣品中氮元素的含量推定蛋白質含量。氮元素含量的測定通過化學滴定完成，需要先把樣品中的氮全部轉化為可以滴定的形式。CuSO4、K2SO4的作用就是將有機物中的氮消化為(NH4)2SO4，然后進行滴定。凱氏定氮法常用于測定天然有機物（如蛋白質，核酸及氮基酸等）的含氮量。

天然的含氮有機物與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮則變成氨，并進一步與硫酸作用生成硫酸銨。此時程稱之為“消化”。

但是，這個反應進行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應的沸點，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進反應的進行。甘氨酸的消化過程可表示如下：

NH2

濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氮，借水蒸汽將產生↑↑↑+++→+3

2224224323NHOHSOCOSOHCOOHCH4

24423)(2SONHSOHNH→+

的氨蒸餾到一定量，一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中的氫離子結合，生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。然后用標準無機酸滴定，直至恢復溶液中原來氫離子濃度為止，最后根據所用標準酸的當量數（相當于待測物中氨的當量數）計算出待測物中的氮量。

OHNHSONaNaOHSONH4424222)4(+→+

↑

+→324NHOHOHNH324333BOHNHBOHNH→+

334324BOHCLNHHCLBOHNH+→+

滴定時用甲烯藍和甲基紅混合指示劑，其指示范圍為pH

5.2~5.6，將NH4H2BO3的藍色滴至原來H3BO3的藍紫色即為終點。

三、儀器及試劑

試劑：

1、濃硫酸（化學純）

2、40%氫氧化鈉（分析純）溶液

3、0.01mol/LH2SO4溶液

4、硫酸鉀、硫酸銅：

5、2%硼酸

6、混合指示劑的配制：0.1%溴甲酚綠本指示劑的變色范圍為pH5.25.45.6→→

紫紅色灰色綠色

儀器：

1、凱氏定氮管

2、定氮儀

3、移液管（1毫升、2毫升）

4、量筒（10毫升）

5、凱氏定氮蒸餾裝置

6、消化爐

7、錐形瓶（150-250毫升）

8、容量瓶（100毫升）

四、操作步驟

1、精確稱取0.4-0.6g烘干衡重的面粉，小心轉入到干燥的定氮管底部，注意切勿沾于瓶口及上部，以免消化不完全引起實驗誤差。然后加入硫酸銅0.3g，硫酸鉀3g及濃硫酸10ml，小瓷片/玻璃珠兩粒，搖勻。

2、消化

置消化爐中消化。消化開始時，應控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當加強火力，繼續消化，直至消化液呈呈藍色透明綠色，再繼續消化0.5h，放置冷卻，冷卻后將瓶內容物轉入100毫升的容量瓶中，并用蒸餾水洗燒瓶數次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度搖勻，做上記號備用。

未加樣品的另一定氮管，與樣品同樣操作，作空白對照。

3、洗滌凱氏定氮儀(教師演示)

4、蒸餾:分別取10.00毫升消化液和12毫升40%氫氧化鈉溶液加入凱氏定氮儀的蒸餾室中，立即水封,接好吸收瓶(瓶中含25毫升2%的硼酸和2滴甲基紅和溴甲酚綠的混合指示劑。蒸餾15分鐘，離管繼續蒸餾2分鐘,水洗接受管.

5、滴定

0.01%硫酸滴定至硼酸吸收液藍色消失.

五、計算

樣品的總蛋白含量（克蛋白%）=

式中：V2為滴定樣品用去的鹽酸平均毫升數；V1為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數；C為稱量樣品的克數：0.0100為鹽酸的摩爾100

10007

.5140100.0)(12?????-CVV

濃度（實際上，此項應按實驗中使用鹽酸的實際濃度填寫）；14為氮的原子量；5.7為常數。

六、注意事項

1、凱氏法的優點是適用范圍廣，可用于動植物的各種組織，器官及生物樣品等成組復雜樣品的測定，只要細心操作都能得到精確的結果。其缺點是操作比較復雜，含有大量堿性氨基酸的蛋白質測定結果偏高。

2、普通實驗室中的空氣中常含有少量的氨，會影響結果，所以操作應在單獨潔凈的房間中進行，并盡可能快地對硼酸吸收液進行滴定。

七、思考題

1.正式測定未知樣品前為什么必須測定標準硫酸銨的含氮量及空白？

2.寫出以下各步的化學反應式：

①蛋白質消化

②氨的蒸餾

③氨的滴定

3.指出本測定方法產生的誤差的原因。

實驗四、麥芽糖化力的測定

在啤酒生產中，大麥芽中淀粉浸出率的多少，主要取決于大麥芽中淀粉糖化酶活力的大小，酶活力越強、糖化中產生的可溶性糖越多，大麥芽的糖化力越高。大麥芽糖化力是以無水大麥芽在20℃、pH4.3、30分鐘內所產生的麥芽糖克數來表示，它是麥芽質量的重要指標之一。良好的淡色麥芽糖化力為250-300。

一、原理

經過發芽、干燥的大麥芽中含有大量的淀粉酶，大麥芽經過破碎、加水保溫后釋放出糖化酶。糖化酶催化淀粉水解為葡萄糖，葡萄糖的醛基被弱氧化劑次碘酸鈉氧化，過量的碘用硫代硫酸鈉滴定。

二、試劑

1．2%可溶性淀粉溶液（試劑4-1）

2．乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（試劑4-2）

3．0.1N碘溶液（試劑4-3）

4．1N氫氧化鈉溶液（試劑4-4）

5．1N硫酸溶液（試劑4-5）

6．0.1N硫代硫酸鈉溶液（試劑4-6）

三．實驗步驟

1．麥芽浸出液的制備

稱取20g粉碎淺色大麥芽加入已知重量的燒杯中，加入480ml水，將燒杯置于40℃恒溫水浴中，保溫1h，保溫過程中以180rpm的速度不斷攪拌，冷卻、補水至凈重520g，攪勻，然后用濾紙過濾，取清夜（即為粗酶液）置于冰箱中保存備用。

2．麥芽糖化液的制備

取100ml2%可溶性淀粉溶液加入200ml容量瓶中，然后加入10mlpH4.6HAc-NaAc緩沖液,搖勻,于20℃恒溫水浴中保溫20min后加入5ml麥芽浸出液,搖勻,20℃繼續保溫30min后,立即加入4ml氫氧化鈉,用蒸餾水定容.

3.空白液制備

取100ml2%可溶性淀粉溶液加入200ml容量瓶中，然后加入10mlpH4.6HAc-NaAc緩沖液和4ml氫氧化鈉,搖勻,于20℃恒溫水浴中保溫20min后加入5ml麥芽浸出液,搖勻,20℃繼續保溫20min后,用蒸餾水定容。

4.碘量法定糖

取50ml麥芽糖化液和空白液各50ml,分別置于250ml碘量瓶中,加入25ml0.1N碘液和3ml,1NNaOH搖勻,蓋好蓋,水封.避光靜置15min后加入4.5ml,1N硫酸,立即用0.1N硫代硫酸鈉滴定至藍色消失.

四、計算

100克風干大麥芽的糖化力:

{[(25N

1-N

2

V

2

)-(25N

1

-N

2

V

3

)]}×34.2×1/0.1,

100克無水大麥芽的糖化力:

{[(25N

1-N

2

V

2

)-(25N

1

-N

2

V

3

)]}×34.2×1/0.1×100/100-w,

其中

N

1

:碘液當量濃度

N

2

:硫代硫酸鈉溶液當量濃度

V

2

:麥芽糖化液消耗的硫代硫酸鈉溶液體積(ml)

V

3

:空白實驗消耗的硫代硫酸鈉溶液體積(ml)

34.2——即0.0171×200/50×500/5×1/20×100，其中0.0171為1ml,0.1000N碘溶液相當于0.0171g麥芽糖

W——麥芽水分含量

五、討論

1．麥芽的糖化液中，加氫氧化鈉后溶液應該呈堿性，pH為9.4-10.6。

2．本實驗中糖分的消耗的碘溶液量，必須在ml之間，否則應增減麥芽浸出液的數量。

實驗五、白酒中雜醇油的測定

雜醇油是指相對分子質量（Mr）比甲醇、乙醇更大的高級醇類的總稱。如丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、己醇和庚醇等。由于它們可以在稀酒精中以油狀析出，故得此名。高級醇是在釀酒過程中，酵母菌代謝過程中產生。

影響雜醇油形成的因素有：

（1）酵母菌種：酵母菌醇脫氫酶活力高時，則雜醇油的形成能力較強。

（2）原料的組成：原料中蛋白質的含量高時，發酵中產生的雜醇油多，如玉米、大米原料中蛋白質含量高，生成的雜醇油多，而薯類原料中蛋白質含量低，產生的雜醇油相應低。

（3）酒曲的蛋白酶活力：曲子中蛋白酶活力高時，原料中蛋白質分解的多，生成相應的雜醇油也多。

雜醇油與有機酸酯化成酯，因此雜醇油是白酒的呈香成分之一，適當的含量可以增加白酒的香味，但是過多的雜醇油也會給白酒帶來邪雜味。雜醇油在人體內氧化慢，對人體的中毒作用與麻醉作用比乙醇強，能引起頭暈頭痛，所以蒸餾酒、配置酒中雜醇油含量不得超過0.20g/100ml。利用雜醇油的沸點比乙醇高的性質，除去酒尾，降低雜醇油的含量。

測定雜醇油常用的方法有比色法及氣相色譜法。比色法只能測出以異丁醇、異戊醇計的高級醇的總量，準確度不高。氣相色譜法可以一次進樣，同時測定甲醇、正丙醇、仲丁醇、異丁醇、異戊醇的含量，分析的準確度和靈敏度也高。由于比色法不需要昂貴的儀器、操作簡便、因此在實驗室常用。本實驗采用對二甲氨基苯甲醛比色法測定白酒中雜醇油的含量

一、原理

高級醇成分復雜，其中以異丁醇、異戊醇的含量較多。在硫酸的作用下，除正丙醇外的高級醇經硫酸脫水后，轉變為不飽和烴。

不飽和烴與對二甲氨基苯甲醛發生縮合反應，生成橙紅色化合物。該化合物的顏色深淺與雜醇油含量成正比。

二、儀器

1．25ml成套比色管

2．分光光度計

三、試劑

1．5g/L對二甲氨基苯甲醛溶液（試劑5-1）

2．標準雜醇油溶液（試劑5-2）

3．無雜醇油的乙醇（試劑5-3）

四、操作步驟

1．標準系列管的制備

按下表吸取雜醇油標準溶液(0.1mg/ml)，置于25ml比色管中，然后在各標準系列管中加水。

試管編號012345

標準雜醇油溶液ml

0.00.20.40.60.81.0

水(ml)2.01.81.61.41.21.0將比色管搖勻后放入冰（或冷）水浴中，沿傾斜的管壁加入4ml濃度為5g/L對二甲氨基苯甲醛溶液，將各管同時搖勻，放入沸水浴中加熱顯色15min后，取出迅速放入冷（或冰）水浴中冷卻，加水定容至10ml，搖勻。

2．試樣管的制備

吸取1.0ml酒樣于10ml容量瓶中，加水定容至刻度，混勻后

吸取1ml置于25ml比色管中。加水至2ml，以下操作同標準系列管的制備。

3．測光密度

在485nm波長下測光密度，繪制標準曲線，從標準曲線上求出試樣管光密度所對應的標準雜醇油量

五．計算

雜醇油（g/100ml）=10m*100/1000VsV1

式中：x——樣品中雜醇油（以異丁醇、異戊醇）的含量，g/100ml

m——樣品稀釋液中的雜醇油含量，mg

Vs——樣品的取液量，ml

V1——測定用樣品的稀釋液體積，ml

1000——由mg換算g

10——酒樣的稀釋倍數

100——換算為100ml試樣中雜醇油的含量

六、討論

1．對二甲氨基苯甲醛對不同高級醇類的顯色程度不相同，對相同量醇類，其顯色靈敏度順序為：異丁醇>異戊醇>正戊醇，而異丁醇的顯色靈敏度很差，正丙醇則完全不顯色。各種酒中高級醇的比例有很大差別。本法采用異丁醇+異戊醇（1：4）混合液作為標準溶液，這種比例不能完全準確地反映白酒中高級醇的真實比例，僅作為同一類型酒的相對比較。準確的測定方法應該用氣相色譜法定量。

2．5g/L對二甲氨基苯甲醛溶液要緩慢沿管壁加入，使沉淀入試管與試樣分為兩層，然后振搖均勻。切勿加入太快，否則局部溫度升高過快，影響比色結果。

3．凡試樣中能脫水生成不飽和烴的化合物，如醛、縮醛、酮和萜等能與對二甲氨基苯甲醛顯色干擾測定。所以醛類含量0.1%以上的試樣，可以先消除干擾再測定，方法如下：吸取50ml酒樣，加入0.25g鹽酸間苯二胺，煮沸回流1h、蒸餾，以50ml容量瓶接收，蒸餾至瓶內尚余約10ml時，補水10ml，繼續蒸餾至餾出液為50ml止。餾出液為供試酒樣。

實驗六、啤酒中雙乙酰含量的測定

雙乙酰及2，3-戊二酮總稱為連二酮，是賦予啤酒風味的重要物質。后發酵中雙乙酰含量的高低已經成為衡量啤酒成熟程度的重要指標之一。雙乙酰在成品啤酒中的含量一般小于0.2

雙乙酰的測定方法有氣相色譜和比色法。本實驗采用比色法測定啤酒中雙乙酰的含量。

一、原理

鄰苯二胺與連二酮的顯色反應，利用生成物的鹽酸鹽在335納米波長小有一最大吸收值，可對連二酮進行定量測定。

二、試劑

1．1%鄰苯二胺溶液（試劑6-1）

2．4N鹽酸溶液（試劑6-2）

3．消泡劑

三、測定步驟

1．蒸餾

于25量筒中加約25毫升水，置于冷凝器下端，使冷凝器下端浸入水中，量取為除氣的啤酒100毫升，加2-4滴消泡劑，迅速加入到已經預熱的蒸餾器中，繼續加熱蒸餾