學必求其心得，業必貴于專精學必求其心得，業必貴于專精學必求其心得，業必貴于專精2020-2021學年新教材人教版生物選擇性必修3教師用書：第3章第2節基因工程的基本操作程序含解析第2節基因工程的基本操作程序課標內容要求核心素養對接闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定。1.科學思維：結合生產實例，舉例說出基因工程的基本操作程序。2．科學探究：針對人類生產和生活的某一需求，嘗試提出初步的基因工程構想,完成初步設計.一、目的基因的篩選與獲取1．目的基因(1）概念:用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因。(2)實例:培養轉基因抗蟲棉用到的目的基因是Bt抗蟲蛋白基因。2．篩選合適的目的基因（1)較為有效的方法：從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選。（2)實例：在培育轉基因抗蟲棉之前，科學家不僅掌握了Bt基因的序列信息，也對Bt基因的表達產物-—Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解。(3）認識基因結構和功能的技術方法：DNA測序技術、遺傳序列數據庫、序列比對工具。3．利用PCR獲取和擴增目的基因(1）PCR的含義：PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫,它是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件,對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。（2)條件:DNA模板、分別與兩條模板鏈結合的2種引物、四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶。（3）過程:①變性：溫度上升到90℃以上,目的基因DNA受熱變性后解為單鏈。②復性：溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。③延伸:溫度上升到72℃左右時，溶液中四種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子鏈。④重復循環多次。（4)結果：每次循環后目的基因的量增加一倍，即成指數形式擴增(約為2n）.二、基因表達載體的構建1．構建基因表達載體的目的(1)使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代。(2)使目的基因能夠表達和發揮作用.2．基因表達載體的組成[填圖］3．基因表達載體的構建首先用一定的限制酶切割載體，使它出現一個切口,然后用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處.三、將目的基因導入受體細胞1．轉化：目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內維持穩定和表達的過程。2．目的基因導入受體細胞的方法（1)目的基因導入植物細胞①花粉管通道法Ⅰ.用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。Ⅱ.在植物受粉后的一定時間內,剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借花粉管通道進入胚囊。②農桿菌轉化法Ⅰ.農桿菌的特點：農桿菌自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物；農桿菌的Ti質粒上的T。DNA能夠整合到所侵染細胞的染色體DNA上。Ⅱ。轉化方法:將目的基因插入農桿菌Ti質粒的T。DNA中，讓農桿菌侵染植物細胞。(2）目的基因導入動物細胞①常用方法：顯微注射法。②常用受體細胞：受精卵。(3）目的基因導入微生物細胞①方法：用Ca2＋處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態,然后將重組表達載體導入其中.②常用受體細胞：原核細胞（使用最廣泛的是大腸桿菌)。四、目的基因的檢測與鑒定1．分子水平檢測（1)通過PCR等技術檢測受體細胞染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測目的基因是否轉錄出mRNA.（2)從轉基因生物中提取蛋白質用相應的抗體進行抗原——抗體雜交，檢測目的基因是否翻譯成了蛋白質。2．個體水平鑒定包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性及抗性程度.基因工程產品需要與天然產品活性進行比較等。判斷對錯(正確的打“√"，錯誤的打“×”)1．從已知結構和功能清晰的基因中篩選目的基因是獲取目的基因的一種有效方法. （√）2．Taq酶是用PCR儀對DNA分子擴增過程中常用的一種耐高溫的DNA連接酶。 (×）提示:Taq酶是耐高溫DNA聚合酶。3．基因表達載體中啟動子是DNA聚合酶識別和結合的部位. (×）提示:啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位。4．將重組表達載體導入動物受精卵常用顯微注射法。 (√)5．轉基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定必須通過分子檢測才能達到目的。 (×）提示：抗蟲效果的鑒定要在個體生物學水平上做抗蟲接種實驗來鑒定.6．可通過PCR等技術檢測棉花的染色體上是否插入了Bt基因. （√)獲取目的基因和構建基因表達載體1．利用PCR獲取和擴增目的基因（1)PCR反應的過程（2)PCR技術與生物體內DNA復制的比較比較項目PCR技術DNA復制區別解旋方式DNA在高溫作用下變性解旋解旋酶催化場所細胞外(在PCR擴增儀內)細胞內（主要在細胞核內)區別酶耐高溫的的DNA聚合酶(Taq聚合酶）DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等溫度條件需控制溫度，在較高溫度下進行細胞內溫和條件合成的對象DNA片段或基因DNA分子聯系①模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進行物質合成②原料：均為四種脫氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶進行催化④引物：均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸2.基因表達載體的構建過程（1）用同一種限制酶或產生相同末端的限制酶切割含目的基因DNA和質粒，使其產生相同末端。(2）將切下的目的基因片段與切開的質粒混合,再加入適量DNA連接酶,使目的基因插入質粒的切口處，形成一個重組DNA分子（重組質粒）。構建過程如下圖所示:合作探究：(1)PCR過程中為什么需要引物?提示：引物是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復制的起始序列，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對。存在于自然界中生物的DNA復制和人工合成中的多聚酶鏈式反應（PCR)之所以需要引物，是因為在DNA合成時DNA聚合酶只能從5′端到3′端合成子鏈。（2)PCR擴增目的基因時，復性溫度的設定是成敗的關鍵.復性溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對，復性溫度過低又會造成引物不能與DNA模板鏈的特定部位結合。復性溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，假設引物的長度相同，在GC含量高時,對復性溫度的設定有什么要求?說明理由。提示：在引物的GC含量高時，設定的復性溫度要高一些。因為DNA分子中G—C之間有三個氫鍵，A—T之間有兩個氫鍵。(3)在利用PCR獲取和擴增目的基因時，從第幾輪循環才會產生完整的目的基因？提示：第3輪1．下列關于PCR反應體系中所加物質作用的描述，錯誤的是（)A．耐高溫的DNA聚合酶用于催化DNA子鏈的合成B．引物使Taq酶能從引物的5′端延伸DNA鏈C．目標DNA母鏈用作合成DNA復制的模板D．四種脫氧核苷酸為PCR提供能量和原料B[通過PCR技術擴增目的基因時,需要用耐高溫DNA聚合酶催化單個脫氧核苷酸聚合形成DNA子鏈,A正確；在復制時，引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后,DNA聚合酶從引物的3′端開始延伸DNA鏈，因此DNA合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，B錯誤；PCR技術的原理是DNA雙鏈復制,DNA復制時兩條鏈均作為復制的模板，C正確;DNA合成的原料是四種脫氧核苷酸,同時兩個核苷酸連接時可釋放能量，D正確.］2．在基因表達載體的構建中，下列說法不正確的是（）①一個基因表達載體的組成只包括目的基因、啟動子、終止子②有了啟動子才能驅動基因轉錄出mRNA③終止子的作用是使轉錄在所需要的地方停止④所有基因表達載體的構建是完全相同的⑤必須在細胞內進行A．②③⑤ B．①④⑤C．①②⑤ D．③④B[基因表達載體的構建是基因工程的核心內容，基因表達載體是載體的一種,除了目的基因外，它還有啟動子、終止子和標記基因等，①錯誤；啟動子是RNA聚合酶的結合位點，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA,②正確;終止子控制著轉錄的結束,③正確；由于受體細胞有植物、動物以及微生物之分,以及目的基因導入受體細胞的方法不同,因此基因表達載體的構建是不完全相同的,④錯誤；基因表達載體的構建必須在細胞外進行,⑤錯誤.②③正確，①④⑤錯誤。故選B。]3．基因工程中可以通過PCR技術擴增目的基因.回答下列問題。（1)生物體細胞內的DNA復制開始時，解開DNA雙鏈的酶是________。在體外利用PCR技術擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是__________。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的________.（2)目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是___________________________________________。［解析]（1)生物體細胞內DNA復制開始時是利用解旋酶進行解旋的，而在體外利用PCR技術擴增目的基因時,則是通過加熱至90～95℃進行解旋的，二者都破壞了堿基對之間的氫鍵。(2)在PCR過程中，要加熱至90～95℃,所以使用熱穩定性高的Taq酶，而不使用在高溫下會失活的大腸桿菌DNA聚合酶。［答案］(1)解旋酶加熱至90~95℃氫鍵(2)Taq酶熱穩定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活4．（2020·江蘇高考）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側的序列,具體流程如圖（以EcoRⅠ酶切為例)：請據圖回答問題：（1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種________酶,它通過識別特定的________切割特定位點。(2）步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′。羥基與5′-磷酸間形成__________；PCR循環中，升溫到95℃是為了獲得________；TaqDNA聚合酶的作用是催化________。（3)若如表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________（從引物①②③④中選擇，填編號）。DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列）已知序列PCR引物①5′.AACTATGCGCTCATGA.3′②5′-GCAATGCGTAGCCTCT。3′③5′.AGAGGCTACGCATTGC-3′④5′-TCATGAGCGCATAGTT。3′（4)對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列.下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列）,結果正確的是________.A．5′。AACTATGCG┈┈AGCCCTT。3′B．5′。AATTCCATG┈┈CTGAATT。3′C．5′.GCAATGCGT┈┈TCGGGAA.3′D．5′.TTGATACGC┈┈CGAGTAC-3′[解析］(1）根據題圖可知，步驟Ⅰ是獲取目的DNA片段,所用的酶EcoRⅠ是一種限制酶，其能識別特定的核苷酸序列,并使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。（2)步驟Ⅱ是將目的DNA片段連接成環狀,其中DNA連接酶的作用是催化相鄰核苷酸之間的3′。羥基和5′。磷酸間形成磷酸二酯鍵.PCR循環中，升高溫度到95℃是為了打開氫鍵使雙鏈解旋,獲得DNA單鏈，TaqDNA聚合酶的作用是催化游離的脫氧核苷酸連接到引物3′端，合成DNA子鏈。(3）引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始延伸DNA子鏈，因為DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，故為擴增未知序列，選擇的與模板鏈相結合的引物應為5′.TCATGAGCGCATAGTT.3′（引物④)和5′.GCAATGCGTAGCCTCT-3′（引物②）。（4）分析題意可知，片段F的兩端為限制酶EcoRⅠ切割后產生的黏性末端，因此其5′端序列應為AATT。，3′端序列應為。TTAA，B正確。[答案］（1）限制性內切核酸（或限制）核苷酸序列（2)磷酸二酯鍵DNA單鏈以DNA為模板的DNA鏈的延伸（3）②④（4）B將目的基因導入受體細胞1．目的基因導入受體細胞的方法受體細胞類型方法說明特點植物細胞農桿菌轉化法將目的基因插入農桿菌Ti質粒的T-DNA上→轉入農桿菌→用農桿菌侵染植物細胞→將目的基因整合到植物細胞染色體的DNA上→目的基因表達經濟、有效，適用于雙子葉植物和裸子植物，尤其適用于雙子葉植物花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭→滴加DNA（含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞→目的基因表達簡便、經濟，我國科學家獨創的一種方法動物細胞顯微注射技術將含有目的基因的表達載體提純→取卵（受精卵)→顯微注射→注射了目的基因的受精卵，經胚胎早期培養后，移植到雌性動物的輸卵管或子宮內→獲得具有新性狀的動物將目的基因導入動物細胞最為有效的方法微生物細胞Ca2＋處理法(感受態細胞法）用Ca2＋處理微生物細胞→感受態細胞→將基因表達載體與感受態細胞混合→在一定溫度下促進感受態細胞吸收DNA分子簡便、經濟、有效2.農桿菌轉化法分析(1）構建攜帶目的基因的表達載體,需要兩種工具酶：限制酶和DNA連接酶。(2）基因表達載體（重組質粒)導入農桿菌細胞時，要用Ca2＋處理農桿菌細胞，使其處于感受態，利于重組質粒的導入.（3)由導入目的基因的受體細胞培育到完整的植株要用到植物組織培養技術。合作探究：1.農桿菌轉化法是將目的基因導入雙子葉植物和裸子植物的一種方法，原因是雙子葉植物和裸子植物能夠產生一種吸引農桿菌的化學物質，而單子葉植物不能產生這種物質,能不能利用農桿菌轉化法將目的基因導入單子葉植物？說明原因。提示:能，可從雙子葉植物中提取該化合物，再用該化合物處理單子葉植物細胞,然后就可用農桿菌轉化法將目的基因導入單子葉植物細胞.2．將目的基因導入動物細胞的受體細胞除了受精卵外，還可以選擇什么細胞？提示：還可以將目的基因導入胚胎干細胞，因為胚胎干細胞也能發育成動物體。1．下列關于目的基因導入受體細胞的描述，不正確的是()A．培育“黃金大米”可用花粉管通道法導入目的基因B．顯微注射技術是轉基因動物中采用最多的方法C．目的基因導入大腸桿菌最常用的方法是Ca2＋處理法D．農桿菌轉化法是將目的基因導入植物細胞最常用的方法A［水稻的花很小，不適合用花粉管通道法導入目的基因，A錯誤;將目的基因導入動物細胞常用顯微注射法，B正確；將目的基因導入微生物細胞最常用的方法是用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的狀態，C正確；將目的基因導入植物細胞最常用的方法是農桿菌轉化法，此外還有基因槍法和花粉管通道法，D正確。]2．農桿菌侵染植物細胞后,能將Ti質粒上的T。DNA插入植物基因組中。圖示為利用農桿菌培育轉基因植物的基本流程,請據圖回答：（1)剪除Ti質粒的某些片段、替換復制原點O與添加抗生素的抗性基因T的過程①中，需用多種限制酶處理,原因是_______________，需用________“縫合"雙鏈DNA片段的平末端。(2）目的基因是指________。由過程②形成的基因表達載體中,目的基因的上游具有________，它是________識別和結合的部位。(3）過程③常用________處理使農桿菌成為感受態細胞.抗生素抗性基因T的作用是________________________________。(4)可通過________技術檢測試管苗的染色體DNA上是否插入了目的基因.［解析］(1）Ti質粒具多種限制酶切割位點，不同的限制酶識別并切割不同的堿基序列。連接平末端應選用T4DNA連接酶。（2)目的基因主要是指編碼蛋白質的基因。目的基因的首端具有啟動子，以便于RNA聚合酶識別和結合。(3）過程③常采用Ca2＋（CaCl2溶液)處理農桿菌,以增大農桿菌細胞壁的通透性。抗生素抗性基因T用于檢測受體細胞中是否含有基因表達載體.(4）檢測農桿菌和愈傷組織細胞中是否有目的基因常采用PCR技術。[答案］(1）不同的限制酶識別并切割不同的堿基序列T4DNA連接酶（2)編碼蛋白質的基因啟動子RNA聚合酶(3)Ca2＋（CaCl2溶液）用于鑒定和篩選導入了基因表達載體的農桿菌(4）PCR［課堂小結］知識網絡構建核心語句背誦1.基因工程的基本操作程序有:(1)目的基因的篩選與獲取；（2）基因表達載體的構建；（3）將目的基因導入受體細胞；（4)目的基因的檢測與鑒定。2．PCR反應液中需要提供DNA模板、分別與兩條模板鏈結合的2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。3．PCR反應中每次循環一般可分為變性、復性、延伸三步.4．基因表達載體的構建是基因工程的核心，基因表達載體是載體的一種，除了目的基因外，它還必須有啟動子、終止子以及標記基因等。5．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法和花粉管通道法。6．將目的基因導入動物細胞常用顯微注射技術，導入微生物細胞常用感受態細胞法（Ca2＋處理法）。1．基因工程主要操作步驟的順序是()①基因表達載體的構建②將目的基因導入受體細胞③目的基因的檢測與鑒定④目的基因的獲取A．③②④① B．②④①③C．④①②③ D．③④①②C［基因工程的主要操作步驟順序是：目的基因的獲取→基因表達載體的構建→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測和鑒定。］2．PCR利用了DNA熱變性的原理，PCR儀實際上也是一種能自動調控溫度的儀器,對PCR過程中“溫度的控制”的說法錯誤的是（)A．酶促反應需要高的溫度，是為了確保模板是單鏈B．延伸的溫度必須大于復性溫度，而小于變性溫度C．DNA聚合酶具有耐高溫的能力D．DNA解旋酶具有耐高溫的能力D[PCR是體外DNA擴增，DNA雙鏈的解開不需要解旋酶,靠高溫使其變性，雙鏈螺旋結構解體，雙鏈分開，在復性后，在耐高溫的DNA聚合酶的作用下根據堿基互補配對原則合成新的DNA,因此延伸的溫度要大于復性溫度而小于變性溫度。]3．下圖為基因表達載體的模式圖，下列有關基因工程中載體的說法錯誤的是(）A．基因表達載體的構建是在生物體外完成的B．任何基因表達載體的構建都是一樣的，沒有差別C．圖中啟動子位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作為標記基因，用于鑒別受體細胞中是否導入了目的基因B[由于受體細胞有植物、動物和微生物之分，以及目的基因導入受體細胞的方式不同，所以基因表達載體的構建也會有所差別,不可能千篇一律。］4．下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。下列相關敘述正確的是（）A．②的構建需要限制性內切核酸酶和DNA聚合酶參與B．③侵染植物細胞后，重組Ti質粒整合到④的染色體上C．④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現出抗蟲性狀D．⑤只要表現出抗蟲性狀就表明植株發生了可遺傳變異D[重組質粒的構建需要限制性內切核酸酶和DNA連接酶參與，DNA聚合酶一般用于DNA復制過程，A錯誤；③侵染植物細胞后,重組Ti質粒上的T.DNA整合到植物細胞的染色體上，B錯誤；如果受體細胞的染色體上含抗蟲基