關于細菌內毒素檢查法第1頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五三、細菌內毒素檢查法（一）概述1.內毒素(Endotoxin)：即革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖，其毒性成分為類脂A，菌體死亡崩解后釋放出來。2.細菌內毒素檢查法：本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。3.什么是鱟試劑？鱟試劑是由海洋生物鱟的血液變形細胞溶解物制成的無菌冷凍干燥品，含有能被微量細菌內毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能夠準確、快速地定性或定量檢測樣品中是否含有細菌內毒素和（1,3）-β-葡聚糖激。

第2頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五鱟的圖片鱟的長相既像蝦又像蟹，人稱之為“馬蹄蟹”,是一類與三葉蟲(現在只有化石)一樣古老的動物。鱟的血液中含有銅離子，它的血液是藍色的。這種藍色血液的提取物——“鱟試劑”，可以準確、快速地檢測人體內部組織是否因細菌感染而致?。辉谥扑幒褪称饭I中，可用它對毒素污染進行監測。

第3頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五4.檢查方法：包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規定外，以凝膠法結果為準。5.檢查的意義：注射劑熱原或細菌內毒素檢查是保證注射劑安全性的重要質量指標。第4頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五（二）凝膠法1.原理：通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法。(限量、陽性對照、靈敏度、溶劑、稀釋倍數）內毒素的量用內毒素單位(EU)表示。該法優點：快速、靈敏。

2.細菌內毒素檢查過程中用到的標準品和試劑①細菌內毒素國家標準品（RSE）：系自大腸桿菌提取精制得到的內毒素。用于標定細菌內毒素工作標準品的效價、復核、仲裁鱟試劑靈敏度。第5頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五②細菌內毒素工作標準品（CSE）：系以細菌內毒素國家標準品為基準進行標定，確定其質量的相當效價。1ng工作標準品效價應不小于2EU，不大于50EU。用于鱟試劑靈敏度的復核、干擾試驗及設置的各種陽性對照。③細菌內毒素檢查用水（BET水）：系指內毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。是細菌內毒素檢查專用水。④鱟試劑和鱟試劑靈敏度：a、鱟試劑的生產：利用鱟血制備而成。鱟試劑的種類：美洲鱟試劑（LAL）、中國鱟試劑（TAL）、圓尾鱟試劑（CAL）。第6頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五B、鱟試劑的規格：是指每支鱟試劑的裝量，如：0.1ml、0.5ml。一般來說，規格是多少就用多少細菌內毒素檢查用水復溶。如：0.1ml就用0.1ml細菌內毒素檢查用水復溶。C、鱟試劑標示靈敏度：細菌內毒素檢查的規定條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度，用EU/ml表示，如：入=0.5EU/ml。⑤細菌內毒素的限值（L）：哺乳動物對細菌內毒素的量有一定的耐受力，只有內毒素超過一定的限度，才會引起熱原反應。因此內毒素的檢查是一個限量檢查，只要不超過限值，產品就合格。確定限值的方法—從質量標準正文中查出。第7頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五⑥最大有效稀釋倍數（MVD）：供試品溶液被允許稀釋的最大倍數，在不超過此稀釋倍數的濃度下進行內毒素限值的測定。MVD=CL/入。L：內毒素限值；c：供試品溶液濃度，當L以EU/ml表示時，c=1.0ml/ml；當L以EU/mg或EU/u表示時，c的單位為mg/ml或u/ml，如：供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD=1例如：稱取mg供試品Vml移取注射液xmlVmlMVD？C最大有效L×m/v=L×c樣≥入,c樣≥入/LEU/mgL·x/v=L×MVD≥入,MVD≥入/LEU/ml第8頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五3.檢查方法（1）檢查程序：①實驗試劑、儀器及用具等的準備；（除內毒素）②確定藥品的細菌內毒素限值L；③選擇鱟試劑的靈敏度入；④計算供試品的最大有效稀釋倍數或最低有效濃度；⑤鱟試劑靈敏度的復核；⑥藥品與鱟試劑的相容性的初選實驗（無干擾濃度初選）；⑦供試品的干擾實驗的驗證（正式干擾試驗）；⑧供試品日常的內毒素限量檢查。在實際操作過程中，（1）→（4）順序可變，（5）→（8）順序不能變。第9頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五(2)實驗準備A、除去干擾：試驗所用器皿需經處理，以除去可能存在的外源性內毒素，常用的方法是250℃干烤至少1小時，也可用其它確證不干擾細菌內毒素的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內毒素并且對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應防止微生物的污染。B、材料與器具：細菌內毒素工作標準品、鱟試劑、細菌內毒素檢查用水、漩渦混合器、37±1℃試管恒溫儀、稀釋、移液容器、試管架或試管浮板、酒精燈、消毒酒精棉球、剪刀、砂輪、鑷子、封口膠布標記紙等。第10頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五(3)鱟試劑靈敏度的復核試驗A、復核的條件：本檢查法規定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU/ml表示。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。第11頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五B、操作：

0.1ml/支規格鱟試劑原安瓿18支

復溶0.1ml內毒素檢查用水4支4支4支4支2支2.0λ內毒素溶液1.0λ內毒素溶液0.5λ內毒素溶液0.25λ內毒素溶液內毒素檢查用水0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml內毒素工作標準品或國家標準品內毒素檢查用水溶解15min稀釋37±1℃保溫1h呈陽性呈陰性結果有效計算鱟試劑靈敏度

式中：X為反應終點濃度的對數值(lg)。反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。當λc在0.5λ～2.0λ時，方可用于內毒素檢查，并以λC為該批鱟試劑靈敏度第12頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五(4)細菌內毒素檢查-凝膠法-干擾試驗按表制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過最大有效稀釋倍數（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。

編號內毒素濃度/配制內毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數所含內毒素的濃度平行管數A無/供試品溶液——————2B2λ/供試品溶液供試品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ4444D無/檢查用水——————2第13頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五干擾試驗結果判定前提：A和D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結果在鱟試劑靈敏度復核范圍內時，試驗方為有效。按下列計算系列溶液C和B的反應終點濃度的幾何平均值（Es和Et）。

Es=lg-1（ΣXs/4)

Et=lg-1（ΣXt/4)式中

Es、Et分別為系列溶液C和溶液B反應終點濃度的對數值(lg)。當Es在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ）及0.5Es~2Es（包括0.5Es和2Es）時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。注：A為供試品溶液；B為干擾試驗系列；C為鱟試劑標示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。第14頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五（5）檢查方法①取內毒素的工作標準品一支，用水稀釋至2入濃度溶液②取檢品S，計算MVD③把它稀釋成SMVD④取鱟試劑8支（0.1ml/支），2支作為樣品檢查管(S1、S2)，2支標記為陽性對照，2支為陽性產品對照，2支標記為陰性對照第15頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五舉例-清開靈注射液中

細菌內毒素的檢查設檢品為S，L=1.0EU/ml，選用效價為0.06EU/支、入=0.06EU/ml的鱟試劑，使用的細菌內毒素的工作標準品的效價為10EU/支。參數及MVD已經過預試驗驗證。操作步驟（1）取內毒素的工作標準品一支，用水稀釋至2入濃度溶液，即E0.12.（2）計算最大稀釋倍數MVD=L/入=1.0/0.06=16倍（3）取檢品S，把它稀釋呈SMVD：0.2mlS+3.0ml水→SMVD16第16頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五（4）取鱟試劑8支（0.1ml/支），兩支作為樣品檢查管(S1、S2)，2支標記為陽性對照，2支為陽性產品對照，2支標記為陰性對照，如下圖所示s1s2陽性對照陽性產品對照陰性對照0.1ml水+0.1mlSMVD160.1ml水+0.1mlSMVD160.1ml水+0.1mlE2入0.1mlE2入+0.1mlSMVD160.2ml水第17頁，共19頁，2023年，2月20日，星期五（5）封閉管口