三章酶的分離純化第1頁/共77頁本章重點各種分離方法的操作原理分離方法的應用原則酶分離純化中應注意的問題第2頁/共77頁酶制劑的來源第3頁/共77頁3.1酶純化的必要性3.2起始材料的選擇3.3酶的萃取3.4分離方法3.5酶純化步驟的設計3.6純化步驟的定量評價3.7在純化過程中酶活力的損失第4頁/共77頁3.1酶純化的必要性生物細胞中同時存在多種多樣的酶。酶在生物細胞中的分布并不是均一的。許多酶可能作用于同一個底物。某種酶的純化程度根據(jù)研究目的而定。第5頁/共77頁3.2起始材料的選擇不顧及酶的來源時，可選擇酶含量高的材料。微生物培養(yǎng)物注意材料的年齡注意在生物體內(nèi)的富集區(qū)域第6頁/共77頁3.3酶的萃?。ㄌ幚硪簯皶r處理，否則在均漿上加一薄層甲苯可以防止微生物感染。）（1）膜和細胞壁的破碎：研磨、超聲波、高壓（注意胞外酶的測定）（2）酶的萃取：萃取液3倍于起始材料

緩沖液(pH7.5)的作用，中和從空泡中放出的大量酸；高離子強度(0.1-0.5)有助于將酶從結(jié)合的膜上解析下來；丙酮粉有助于將酶與脂肪或磷脂膜分離。注意事項：蛋白酶的抑制方法（低溫快速、抑制劑）制備丙酮粉用以解除酶與脂肪或磷脂膜的結(jié)合。除去核酸：調(diào)整pH沉淀（魚精蛋白硫酸鹽或鏈霉素）、水解第7頁/共77頁3.4酶的分離方法（1）以大小或質(zhì)量為依據(jù)：離心（300000g)、凝膠過濾（Sephadex交聯(lián)葡聚糖、Bio-Gel交聯(lián)聚丙烯酰胺）、透析、超過濾（2）以電荷為依據(jù)：離子交換色譜（低離子強度、適當pH）Sephadex、DEAE-纖維素、CM-纖維素；電泳（電荷、分子大小、分子形狀）紙、纖維素粉末、淀粉、聚丙烯酰胺；等電聚焦（pH梯度中的平衡位置）第8頁/共77頁（3）以溶解度變化為依據(jù)：改變pH、改變離子強度、降低介電常數(shù)（4）以特異性結(jié)合位置為依據(jù)：親和色譜、親和洗提（5）其它方法：熱變性、在磷酸鈣凝膠柱上分級吸附、羥基磷灰石色譜、疏水色譜、用水溶性的非離子聚合物（聚乙二醇）沉淀、冷凍干燥濃縮第9頁/共77頁分離方法分解第10頁/共77頁(1)以大小或質(zhì)量為依據(jù)離心凝膠過濾透析和超過濾第11頁/共77頁1.1離心原理：以質(zhì)量不同為分離依據(jù)離心力5000-50000g處理量可達幾升分離對象:細胞碎片、沉淀下來的酶第12頁/共77頁高速離心速度一般在20,000以下。超離心相對離心力場速度在75,000

g以上，在80,000~250,000g之間。主要分離小分子量酶。沉降速度,離心法（區(qū)帶離心法），等密度梯度離心法（沉降平衡法）。第13頁/共77頁1.2凝膠過濾原理：不同大小的分子進入顆粒狀凝膠內(nèi)微孔的能力不同，能進入微孔的小分子被阻滯，不能進入微孔的大分子未被阻滯。換句話說，分離是因為不同分子在進入或不進入凝膠所經(jīng)過的路程不同而達到分離的目的。其他名稱：分子篩層析、凝膠滲透層析、排阻層析第14頁/共77頁Sephadex(交聯(lián)葡聚糖）、Bio-Gel(交聯(lián)聚丙烯酰胺）酶后期處理（小量試樣）第15頁/共77頁葡聚糖凝膠操作流程：1）選擇根據(jù)分子量大小范圍選擇凝膠。

凝膠如:G50排阻1,500-30,000（Sephadex）

還有粗，中，細分，細的分辯率高,流速慢；粗的分辯率低,流速快。2）溶漲水浸或沸水煮，快而可以殺菌，防止微生物污染。3）裝柱不能有氣泡，用緩沖液平衡4）上樣按柱床體積計算約1/40左右。 然后用緩沖液洗脫。注意流速。5）再生稀鹽和緩沖液洗滌，保存在液體中，為防止微 生物生長，加0.02%NaN3使用時要注意可能抑制你要分離的酶。第16頁/共77頁聚丙烯酰胺凝膠丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺聚合而成。

Bio-Gel P-2數(shù)字后面乘1000表示最高排阻分子量 分離生物大分子的范圍與葡聚糖凝膠 基本相同瓊脂糖凝膠是瓊脂去除瓊脂膠后得到D-半乳糖和6-脫水Sepharose半乳糖相間排列而成。如：4B即瓊脂糖含量占4%。

另外的商品Bio-GelA是瓊脂糖與丙烯酰 胺交聯(lián)而成。Bio-GelCL，比上述二種化學穩(wěn)定性和機械強度更好，應用更大。

作用：濃縮，脫鹽等，分級分離

第17頁/共77頁1.3透析和超過濾透析膜：帶有微孔的篩子小于等于20000的大分子通過，更大的分子不通過。除去酶液的鹽、有機溶劑或低分子量的抑制劑超過濾：在0.29MPa氮氣壓力下使酶液透過透析膜。濃縮酶液第18頁/共77頁(2)以電荷為依據(jù)離子交換色譜電泳等電聚焦第19頁/共77頁2.1離子交換色譜取決于帶相反電荷基團的靜電吸引。DEAE-纖維素（二乙基氮基乙基-纖維素）結(jié)合帶負電荷基團，陰離子交換劑CM-纖維素（羧甲基-纖維素）結(jié)合帶正電荷基團，陽離子交換劑第20頁/共77頁離子交換纖維素:是纖維素作為母體，引入相應的交換基團，蛋白質(zhì)不容易變性，交換容量大（0.2-1.0mg/克干膠）離子交換樹脂:聚苯乙烯樹脂引入相應的解離基團， 分陰，陽離子交換樹脂。 有強酸，強堿，弱酸，弱堿。離子交換凝膠:葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠為母體，導入相應的交換基團，交換容量更大2.5- 4.5mg/克干膠）第21頁/共77頁1）離子交換劑選擇：考慮酶穩(wěn)定性需要

酶蛋白在くpI的pH條件下穩(wěn)定用陽離子交換劑。酶蛋白在〉pI的pH條件下穩(wěn)定用陰離子交換劑在﹤pIpH,﹥pIpH條件下穩(wěn)定二種交換劑都可用

2）如何選擇強型和弱型交換劑

酶蛋白pI在<6或>9時考慮用強型離子交換劑

酶蛋白在強型或弱型離子考慮到酶的不穩(wěn)定性，交換劑通用，選弱型。第22頁/共77頁解吸方法：改變pH（改變結(jié)合基團的電荷），提高溶液的離子強度（與酶競爭結(jié)合位置）使用規(guī)?？纱罂尚〖兓稊?shù)為10左右第23頁/共77頁2.2電泳原理：在外加電場的影響下，帶電分子具有不同的運動速度。支持介質(zhì)：紙、纖維素粉末、淀粉、聚丙烯酰胺小規(guī)模或分析水平，也可在制備水平第24頁/共77頁2.3等電聚焦依據(jù)：在pH梯度中的平衡位置。用兩性電解質(zhì)，多乙烯多胺與丙烯酸的同系多異構(gòu)體混合物。在電場作用下，形成連續(xù)平滑的pH梯度，而酶樣品在其中也形成相同的等電點pH梯度。分辯率高，pI相差0.01pH的酶與蛋白質(zhì)可分離

。注意：在pI附近蛋白質(zhì)容易沉淀，影響分離的數(shù)量和質(zhì)量。第25頁/共77頁聚焦層析：兼有等電聚焦靈敏度高和柱層析簡便的雙重特點。第26頁/共77頁原理：

用特定的多緩沖液滴定和淋洗層析柱特定的多緩沖交換劑，隨著緩沖液的擴展，會自上而下建立pH梯度，而蛋白質(zhì)也在相應pH梯度處聚焦，隨著緩沖液的下移而下移，最后從層析柱中流出來。關鍵：選好多緩沖交換劑和多緩沖液。如：PBE94陰離子交換劑和Polypuffer96多緩沖液。第27頁/共77頁流程:1）選好多緩沖液和多緩沖交換劑2）調(diào)整起始緩沖液pH上限,用平衡的多緩沖交換劑裝柱，3）調(diào)整起始緩沖液pH梯度下限,用下限緩沖液5~10毫升過柱4）上樣品，用這個下限緩沖液洗脫，并分部收集。5）多緩沖交換劑再生和平衡。操作1.PBE118應用pH范圍：pH9以上

PBE94應用pH范圍：pH9～6或pH7～4

2.選pH梯度已知酶的等電點，選擇酶在1/3～1/2處洗出，分辯率高，而且省材料和時間。3.上樣量20～30ml柱床體積,可分離～200mg蛋白質(zhì)/pH4.洗脫液量一般為10倍柱床體積5.流速30～40ml/小時6.再生和儲藏用1mmol/LNaCl洗滌，0.1NHCl洗，用高pH緩沖 液平衡，放適宜pH的起始緩沖液保存。可以加 24%乙醇，4℃保存。第28頁/共77頁快速液相層析（離子交換層析,monoQ;monoS）： 用于聚焦層析（monoP)第29頁/共77頁（3）以溶解度變化為依據(jù)鹽析

有機溶劑沉淀法 選擇性沉淀法 共沉淀法

PEG沉淀法、

等電點沉淀法第30頁/共77頁3.1改變pH調(diào)整pH至酶的等電點。原理：溶解度隨分子引力加大而減小，其他條件相同，只pH在等電點附近,分子引力最大，蛋白質(zhì)就沉淀。

一般不單獨使用，配合其他方法使用。第31頁/共77頁3.2改變離子強度鹽溶現(xiàn)象：加入離子有助于分散大分子上所帶的電荷而使溶解度提高。鹽析：離子強度提高到超過某一數(shù)值，帶電分子將會沉淀下來。第32頁/共77頁特點：1.最古老,但應用廣2.常用NH4)2SO4，因為溶解度大0℃時，(NH4)2SO4溶解706g/L;25℃時，(NH4)2SO4溶解767g/L;

在0℃時也能把幾乎所有的蛋白鹽析出來。第33頁/共77頁

最好用分析級鹽析

從55%開始有沉淀析出65%時有50%沉淀75%時有70~80%沉淀 100

蛋

白 質(zhì)50 濃 度

0

20406080100%

(NH4)2SO4濃度(以百分飽和度表示)蛋白質(zhì)濃度第34頁/共77頁1）小樣試驗：

鹽析常數(shù):由蛋白質(zhì)性質(zhì)、鹽種類決定

logS=β-KI

鹽析常數(shù)

離子強度蛋白質(zhì)溶解度

是蛋白質(zhì)在純水中([I]=0)

S的外推對數(shù)值 與蛋白質(zhì)種類、溶液、溫度、pH決定2）成功的關鍵：pH=等電點（pI）

蛋白質(zhì)濃度<100ug/ml，不沉淀 200～1000ug/ml,沉淀時間長 >1000ug/ml,沉淀快主要用于分級沉淀，在0℃左右進行。常用(NH4)2SO4，溶解度大，T影響小。第35頁/共77頁操作方式：常用加飽和(NH4)2SO4溶液或加固體（NH4)2SO4

缺點：脫鹽（對濃鹽溶液透析），分辨率低。

優(yōu)點：簡便、安全、重復性高。第36頁/共77頁3.3改變介電常數(shù)

加與水相混的有機溶劑，改變?nèi)芤航殡姵?shù)，增加蛋白質(zhì)間靜電作用力，減弱蛋白質(zhì)與溶劑分子之間的作用，導致蛋白質(zhì)聚集而沉淀。另一作用脫水。有機溶劑沉淀法第37頁/共77頁1)溫度0℃下操作。常用丙酮,還有甲醇,乙醇等，有機溶劑先在-15～20℃下預冷，沉淀后立即在低溫下離心分離。2）pH=pI3）[I]

常加5~10%(NH4)2SO4，以提高分離效果， [I]<0.05M可以提高分辨率和酶穩(wěn)定性4)沉淀后馬上用緩沖液溶解，減少有機溶劑濃度。優(yōu)點:分辯率高且易去除，與pI同時使用，用于酶粗分缺點：對有機溶劑不穩(wěn)定的酶，容易變性。第38頁/共77頁多聚電解質(zhì)聚丙烯酸（PAA）等雜多酸，在低濃度時，選擇性地與某種（某類）酶絡合沉淀。作用機制還不清 PAA+酶溶液（酶+雜蛋白） 溶菌酶，蛋白酶等

（PAA酶）沉淀+雜蛋白（在溶液中）

Ca++

酶在溶液中+（PAACa++）沉淀

SO42–

PAA+CaSO42–

沉淀

成功關鍵是PAA的分子量

選擇性沉淀法第39頁/共77頁共沉淀法利用離子聚合物（SDS），非離子聚合物(聚乙二醇，聚乙烯亞胺，單寧酸)等，在一定條件下與蛋白質(zhì)直接或間接形成絡合物，使蛋白質(zhì)，酶一起沉淀，再用適當方法把酶溶解下來。第40頁/共77頁PEI（聚乙烯亞胺）+菌體超聲上清液（酶） 0.2MKCl(DNA)PEI雜蛋白質(zhì)和酶）沉淀 0.6MKClEcoRI(酶)被溶解下來+(DNA)-PEI-雜蛋白沉淀， 不溶解第41頁/共77頁為水溶性非離子型聚合物，方法同(NH4)2SO4,但與PEG分子量有關系。

優(yōu)點：PEG對蛋白質(zhì)活性構(gòu)象起穩(wěn)定作用。

缺點：PEG分子量大，溶液粘度大，操作難。 分子量小，用PEG多才能使蛋白質(zhì)沉淀，

PEG用后，要去除；PEG價格很貴，不太用于大量樣品。常用PEG4000，6000。一般蛋白質(zhì)濃度在10mg/ml以下，控制pH=pI，T=～20℃。PEG以固體或50%液體形式聚乙二醇（PEG）沉淀第42頁/共77頁以上方法基本上是“固—液”分離方法?！耙?-液”分離純化：酶，雜蛋白都在液相中。液相包括一相或多相，但不相溶。K=C上/C下分配系數(shù)不同，酶和蛋白質(zhì)的介電常數(shù)介于0.1~1.0之間。

優(yōu)點：比較適合大量樣品分離。

缺點：成本高，去除液相成分困難。第43頁/共77頁親和色譜親和洗提（4）以特異性結(jié)合位置為依據(jù)第44頁/共77頁4.1親和色譜原理：酶的底物或競爭性抑制劑通過共價鍵與惰性載體（如瓊脂糖）相連接，形成親和載體。當混合物通過親和載體時，酶由于與底物或競爭性抑制劑之間有特異性相互作用而保留在柱子上，其他酶和雜蛋白被洗出柱子。然后加入底物進行競爭，或改變pH或離子強度使結(jié)合的酶解吸。第45頁/共77頁原則上可以從粗萃取液中獲得純酶。問題：（1）親和載體的制備較難；（2）親和載體與酶的特異作用減弱或喪失；（3）親和載體和酶之間的相互作用強度必須落在一個正確的范圍以內(nèi)；（4）如果催化反應體系中有兩個底物，會產(chǎn)生一些特殊問題。第46頁/共77頁4.2親和洗提相互作用的特異性表現(xiàn)在從色譜的支持材料解吸這一階段。酶和其它化合物一起先吸附到一種離子交換劑上，再用適當?shù)牡孜锾禺惖叵刺?。特點：（1）不需要將配位體與載體相連；（2）可采用高竄量的柱子。第47頁/共77頁親和層析：

原理：層析柱的固相載體上通過結(jié)合了專一與酶分子上特殊基團結(jié)合的配基（底物，顏料、抑制劑等)，酶通過層析柱時，酶可以專一地被配基通過非共價鍵結(jié)合，非專一結(jié)合的雜蛋白被洗滌下來。通過改變洗脫條件，酶又被解吸下來。從而達到分離的目的。第48頁/共77頁步驟：1．制備親和層析柱，或買或自備Sepharose4B用BrCN活化，使載體可以通過共價鍵結(jié)合牢配基2．選擇合適的配基，進行偶聯(lián)3．去除未偶聯(lián)的配基4．選擇合適的緩沖液平衡親和層析柱5．上樣，象一般的柱層析一樣6．洗滌,去除未不親和的雜蛋白，非專一性吸附物7．把酶洗脫下來8．親和柱脫鹽，再生，換成可再親和吸附的狀態(tài)。注意：載體結(jié)構(gòu)松,親水,有大量與配基結(jié)合的基團，經(jīng)得起反復操作時的強度和pH、I、T的處理第49頁/共77頁配基與酶有適當強度的親和力：

Kass

配基+酶配基——酶

Kdiss10–4M〉Kdiss〉10–8M或者104M〈Kass〈108M

要有供偶聯(lián)固定的活潑基團，又能與載體結(jié)合，配基的結(jié)合量在20umol/ml，有時還要接臂，以改善親和吸附效果。上樣量

按吸附力大小，吸附力大，樣品量大些。樣品量控制在柱體積的5%以內(nèi)。蛋白質(zhì)濃度不要超過30mg/ml，流速約10ml/cm2.

h。洗脫方法選擇:

改變溫度，離子強度，pH，改變?nèi)軇┫到y(tǒng)，電泳，例：Sepharose4B↓CNBr在堿性條件下活化，并洗去多余的CNBr

↓

偶聯(lián)S.aureus細胞壁肽聚糖↓

洗去未偶聯(lián)的S.aureus細胞壁肽聚糖↓用樣品同樣的緩沖液平衡柱，并上樣和洗滌，↓改變上樣時條件，把吸附的Lysostaphin洗脫下來第51頁/共77頁（5）其它方法

吸附：物理吸附白土，氧化鋁，磷酸鈣膠等。 如0.005~0.01M,pH5.0~6.5磷酸緩沖液吸附提高緩沖液pH，把吸附的酶洗脫下來。羥基磷灰石為微晶型磷酸鈣制品，鈣離子與蛋白質(zhì)的負電性基團相互作用。 磷酸基團與蛋白質(zhì)的正電性基團相互作用。

第52頁/共77頁羥基磷灰石常常吸附中、酸性蛋白質(zhì)，排除酸性蛋白質(zhì)。洗脫可以用階梯或梯度洗脫

如在0.001M磷酸緩沖液pH6.8平衡液中進行，吸附一段時間后，提高離子強度到0.01~0.5M磷酸緩沖液第53頁/共77頁選擇性熱變性：加熱到一個酶穩(wěn)定的溫度條件下)，使不穩(wěn)定的雜蛋白變性沉淀，消除雜蛋白方法舉例：準備好沸水浴→蚯蚓纖溶酶均漿液迅速放入 →到達變性溫度55℃，保溫1h→取出，冷水冷卻 →離心

一般放入時防止局部溫度過高而變性，通常變性溫度選擇在>穩(wěn)定溫度10℃時第54頁/共77頁選擇性熱變性選擇性酸堿變性選擇性表面變性根據(jù)穩(wěn)定性差異分離第55頁/共77頁蚯蚓纖溶酶總蛋白mg

總活力μ比活力純化倍數(shù)回收率原液716.72472.53.451.0100熱變性268.62620.89.762.83106TI-agarose4B17.572338133.138.696.6DEAE-cellulose5.68106318754.443.9Arg-agarose4B0.85531622180.621.9酸堿變性：酶和雜蛋白受到酸堿影響程度不同，如細胞色素C可用2.5%三氯醋酸處理，大部分雜蛋白就可以去除。

如麥芽中提取β-淀粉酶，pH3時α-淀粉酶失活,無活性。

缺點：操作繁，純化效率低。第56頁/共77頁表面變性：酶溶液和惰性液體（氯仿）混合振蕩，造成選擇性表面變性。一般上層為未變性蛋白，中間層變性蛋白，下層為氯仿。

操作要點：處理時間不要過長，防止酶蛋白的變性。

第57頁/共77頁結(jié)晶當酶達到一定純度和濃度后，加入晶種，在一定條件下，經(jīng)緩慢的過程，使酶的溶解度降低，酶慢慢結(jié)晶出來。時間可以從幾小時，幾天，幾個月，甚至幾年。結(jié)晶成功關鍵 1．濃度要在1~5%為宜。 2．純度要高。 3．酶要有活性第58頁/共77頁純化方法的組合先：選擇性變性去除大部分雜蛋白。中間:吸附法 減少體積。或鹽析脫鹽，最好放后一些，可免脫鹽有機溶劑沉淀如體積大，可放前面使用。后：離子交換,膠過濾，一般不能用大體積，操作 聚焦層析,親和層析有難度，可在后面用最后：結(jié)晶要有一定純度和濃度，放在最后第59頁/共77頁3.5酶純化步驟的設計第60頁/共77頁1）切記酶是蛋白質(zhì)，防止酶失活變性

a.低溫

b.一般中性，<4,>10不穩(wěn)定,局部酸、堿過高

c.蛋白變性（操作時形起泡沫）

d.重金屬,有機溶劑,微生物及蛋白酶污染2）手段可激烈一些

3）蹤酶分離每一步的總活力和比活力，判別每步方法的可行性。3.5.1酶分離純化的基本原則第61頁/共77頁3.5.2選擇純化方法時注意事項（1）試樣的體積、酶和雜質(zhì)的數(shù)量、pH及離子強度。（2）酶的物理化學性質(zhì)：大小、等電點、溶解度、親水性（3）需要純化的酶的生物學性質(zhì)：穩(wěn)定性、輔助因子第62頁/共77頁3.5.3分離方法的順序選擇試樣量由大到小分辨率由低到高酶的回收率由低到高第63頁/共77頁初步純化選擇性純化進一步純化檢查純化的進展情況有機溶劑、硫酸銨沉淀、磷酸鈣分級吸附、親和色譜、超濾離子交換色譜、凝膠過濾色譜、親和色譜、聚焦色譜、疏水色譜SDS電泳、等電聚焦第64頁/共77頁純化方法的組合：先：選擇性變性去除大部分雜蛋白。中間:吸附法 減少體積。或鹽析脫鹽，最好放后一些，可免脫鹽有機溶劑沉淀如體積大，可放前面使用。后：離子交換,膠過濾，一般不能用大體積，操作 聚焦層析,親和層析有難度，可在后面用最后：結(jié)晶要有一定純度和濃度，放在最后第65頁/共77頁幾個環(huán)節(jié)：預處理→抽提→濃縮→純化→酶的制品（1）預處理

目的： 酶從生物樣品中拿出來

動、植物組織組織糜→絞肉機切碎， 高速組織搗碎機，局部高溫 加沙研磨，注意吸附

破壁：均漿器，冷熱破壁法

丙酮干粉：使用0℃磨碎→加-20℃丙酮預冷1~

5V→過濾→低溫干燥→研磨過篩 優(yōu)點：破壁，去脂肪和水分，節(jié)酶溶解

缺點：有機溶劑不穩(wěn)定，小心酶失活，注意低溫第66頁/共77頁

細菌：量少超聲波，溶菌酶量多丙酮干粉自溶法：一定溫度，離子強度下保溫，或加甲苯，使菌體自溶液化

缺點：引入細胞其他成分，成分復雜，使分離酶失活破壞

霉菌：機械剪切，磨碎，細胞壁用溶菌酶

酵母：自溶法蝸牛酶冷凍破壁法第67頁/共77頁（2）抽提

a.普遍抽提b.選擇性抽提

pH：

酸性蛋白堿性溶液堿性蛋白酸性溶液

鹽：低鹽溶液有利于酶蛋白溶解0.02—0.05M磷酸緩沖液，0.15MNaCl

用檸檬酸鈉螯合金屬離子，切斷與其他物質(zhì)結(jié)合溫度：0～4℃之間，有的可以高一些（室溫）

其他：防止氧化加CySH,DTT,巰基乙醇;防蛋白酶水解，加蛋白酶抑制劑(如苯甲磺 酰氟（PMSF）)等；防止有機溶劑的影響第68頁/共77頁