關于常用分子生物學技術的原理及其應用第1頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三分子雜交與印跡技術分子雜交印跡技術印跡技術的類別及應用1PART①②③MolecularHybridizationBlottingTechnique第2頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三在DNA復性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交的原理1.核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)第3頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.雜化雙鏈的形成第4頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三二、印跡技術

1.印跡技術利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術。第5頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.印跡技術流程硝酸纖維素膜（NC）尼龍膜PVDF膜固定蛋白質，多糖和核苷酸第6頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三用放射性核素、生物素或熒光染料標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。3.探針技術第7頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三第8頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三二、印跡技術的類別及應用

Lipids脂類Phosphomoieties磷酸基團Glycoconjugates復合糖第9頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三1.DNA印跡

(Southernblotting)2.RNA印跡(Northernblotting)3.蛋白質的印跡

(Westernblotting)用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質定性定量及相互作用研究。二、印跡技術的類別及應用

第10頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三三種印跡技術的比較80℃雜交（紫外交聯儀）第11頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三1.DNA印跡

(Southernblotting)第12頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三放射自顯影照片第13頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.RNA印跡(Northernblotting)NorthernblotanalysisofEGFandTGF-α

inthenormalpancreasandpancreaticcancer.NatureProtocols4,37-43(2008)Themembranewasprobedwiththe32P-labeledEGForTGF-α

cDNAand,asaloadingcontrol,the7ScDNA.第14頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三3.蛋白質的印跡

(Westernblotting)沉淀化學發光熒光第15頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三4.其他：4.1斑點印跡(dotblotting)等位基因特異的寡核苷酸

（Allele-specificoligonucleotide，ASO)鐮狀細胞性貧血sicklecellanemia

由編碼血紅蛋白（beta-hemoglobin）基因突變導致

第16頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三4.2原位雜交(insituhybridization)間接標記直接標記?2005NaturePublishingGroupSpeicher,M.R.etal.人黑色素瘤組織切片：角蛋白Keratin5（基底上皮細胞和細胞骨架）第17頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三4.3DNA芯片技術(DNAarray)第18頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三PCR技術的原理與應用PCR工作原理PCR技術的主要用途2PART①②ThePrincipleandApplicationof

PCRTechnology第19頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三1.聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction,PCR)一、PCR技術的工作原理1983年27歲年輕科學家Mullis發明獲得了1993年的諾貝爾獎1969年ThomasD.Brock報道了在黃石公園溫泉中發現了一種新的細菌Thermusaquaticus(Taq)1971年DNApolymerase從T.aquaticus分離出來，這種酶可以在75℃高溫保持活性。第20頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三5Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

5

5TemplateDNA55555555第21頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循環后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。第22頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.PCR技術原理示意圖第23頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+3.PCR體系基本組成成分第24頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三4.PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第25頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三PCR的原理演示第26頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段,或與逆轉錄反應相結合，直接以組織和細胞的mRNA為模板獲得目的片段從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序列相似的新基因片段的主要方法二、PCR技術的主要用途1.目的基因的克隆第27頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三利用PCR技術可以隨意設計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。PCR技術高度敏感，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。3.DNA和RNA的微量分析2.基因突變第28頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三將PCR技術引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。PCR與其他技術的結合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。4.DNA序列測定5.基因突變分析第29頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三目的：從組織或細胞中獲得目的基因對已知序列RNA進行定性和半定量1.逆轉錄PCR技術（ReversetranscriptionPCR）三、幾種重要的PCR衍生技術CrystallographicstructureofHIV-1reversetranscriptase核酸酶聚合酶第30頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三PCR的原理演示第31頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三HIVRetrovirusreversetranscription（optional）第32頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三原位PCR方法將目的基因的擴增與定位相結合。2.原位PCR技術(insituPCR)第33頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三3.實時PCR技術通過動態監測反應過程中的產物量，消除了產物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標記引物RQ3'3'5'5'第34頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三3.1實時PCR技術原理第35頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三3.2實時PCR分類：實時PCR非探針類SYBRGreen（DNA小溝）探針類1.TaqMan探針法（累積熒光）2.分子信標探針法（發卡結構）3.FRET探針法（實時可逆）第36頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三第37頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三TaqMan探針法實時PCR原理示意圖第38頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三PCR和Realtime的比較演示第39頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三基因文庫基因組DNA文庫cDNA文庫3PART①②GeneLibrary第40頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。對基因結構和功能進行研究的第一步第41頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區和非編碼區）以DNA片段形式貯存的克隆群體。用于構建基因組文庫的載體有噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。一、基因組DNA文庫第42頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三1.基因組文庫和cDNA文庫的構建和篩選~20kb第43頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選2.基因組文庫篩選結果舉例第44頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三二、cDNA文庫cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部mRNA經逆轉錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。第45頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三納米抗體噬菌體文庫的構建第46頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三生物淘篩M13phage第47頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三生物芯片技術基因組DNA文庫cDNA文庫4PART①②BiologicalChipTechnique第48頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三是指將許多特定的DNA片段有規律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統等對芯片進行掃描，通過計算機系統對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結果。該技術亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片1.基因芯片(genechip)第49頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.基因芯片工作流程示意圖Heatmap第50頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三DNAmicroarray的原理演示第51頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經檢測系統對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術。二、蛋白質芯片蛋白質分子間的親和反應1.蛋白質芯片(proteinchip)2.蛋白質芯片作用原理第52頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三Proteinmicroarray的原理演示第53頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三生物大分子相互作用研究技術蛋白質相互作用研究技術DNA蛋白質相互作用分析技術5PART①②TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy第54頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三一、蛋白質相互作用研究技術為什么研究蛋白質相互作用？研究蛋白質復合物DNA的復制和轉錄蛋白質的合成和分泌信號轉導和代謝第55頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三標簽融合蛋白結合實驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質體外直接相互作用的方法。1.親和分析（標簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）應用：證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結合分析兩種分子結合的具體結構部位篩選細胞內與融合蛋白相結合的未知分子第56頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三標簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖第57頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三2.酵母雙雜交技術的基本原理和用途利用酵母轉錄激活因子GAL4的生物特性DNA結合區（bindingdomain，BD）促進轉錄的活性區（activationdomain，AD）基因表達激活第58頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三酵母雙雜交技術的基本原理演示第59頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三酵母雙雜交系統的應用證明兩種已知基因序列的蛋白質可以相互作用的生物信息學推測。分析已知存在相互作用的兩種蛋白質分子的相互作用功能結構域或關鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達質粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因表達文庫，篩選未知的相互作用蛋白質。第60頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三二、DNA-蛋白質相互作用分子分析技術為什么研究DNA和蛋白質相互作用？研究DNA-蛋白質復合物基因表達的基礎研究基因表達調控的機制研究對象轉錄因子所結合的特定DNA序列基因的調控序列所結合的蛋白質第61頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三Electrophoreticmobilityshiftassay，EMSADNA結合蛋白與相應DNA序列間的相互作可以做定性和定量分析是轉錄因子研究的經典方法。研究RNA結合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。1.電泳遷移率變動測定核心：蛋白質與DNA探針結合會增大其分子量第62頁，共68頁，2023年，2月20日，星期三放射自顯影未結合探針結合有蛋白的探針標記探針