免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù)第1頁/共43頁免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù)第2頁/共43頁一淋巴細(xì)胞的功能檢測

淋巴細(xì)胞功能測定可分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要是間接了解淋巴細(xì)胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)；體外實(shí)驗(yàn)主要包括淋巴細(xì)胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)及淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)物的測定第3頁/共43頁淋巴細(xì)胞T細(xì)胞（負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫功能）B細(xì)胞（執(zhí)行體液免疫功能）NK細(xì)胞（非特異性免疫作用）第4頁/共43頁一、T細(xì)胞功能的檢測T細(xì)胞增殖試驗(yàn)T細(xì)胞分泌功能測定T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)體內(nèi)試驗(yàn)第5頁/共43頁（一）T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)1.原理：淋巴細(xì)胞DNA合成分化母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴(kuò)大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松第6頁/共43頁

未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞過渡型細(xì)胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個(gè)有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無第7頁/共43頁2.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激物非特異性刺激物：

PHA------T細(xì)胞

ConA-------T細(xì)胞

PWM-------T、B細(xì)胞

LPS-------B細(xì)胞特異性刺激物：異種抗原同種組織抗原

第8頁/共43頁3.檢測方法

形態(tài)法：刺激物淋巴細(xì)胞（4-6天）母細(xì)胞化同位素法：PHA淋巴細(xì)胞（54h）

DNA合成期+3HTdR摻入

收集細(xì)胞

檢測β射線

測定細(xì)胞內(nèi)的3H－TdR第9頁/共43頁（1）形態(tài)學(xué)檢查法第10頁/共43頁方法學(xué)評(píng)價(jià)：優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)學(xué)方法簡便易行，普通光學(xué)顯微鏡便能觀察結(jié)果，適于基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。缺點(diǎn)：是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。第11頁/共43頁培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞全血分層液離心過濾測量放射性（2）3H-TdR摻入法第12頁/共43頁優(yōu)點(diǎn)：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強(qiáng)，重復(fù)性好。缺點(diǎn)：但需一定設(shè)備條件，同時(shí)還存在放射性核素污染問題。第13頁/共43頁培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞全血分層液離心過濾測量放射性MTT測吸光度(3)MTT比色法第14頁/共43頁(二)T細(xì)胞分泌功能測定

體外培養(yǎng)的T細(xì)胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后,分泌各種細(xì)胞因子,可借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)分別檢測細(xì)胞因子含量、生物學(xué)活性或基因表達(dá)水平，以反映T細(xì)胞功能。

第15頁/共43頁（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)1.原理：靶細(xì)胞抗原T細(xì)胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細(xì)胞第16頁/共43頁形態(tài)學(xué)方法：淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)殘留腫瘤細(xì)胞2.方法意義：腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力

第17頁/共43頁圖15-2T細(xì)胞細(xì)胞毒試驗(yàn)示意圖第18頁/共43頁靶細(xì)胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應(yīng)細(xì)胞測量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時(shí)51Cr釋放法第19頁/共43頁(四)體內(nèi)試驗(yàn)特異性抗原皮膚試驗(yàn)PHA皮膚試驗(yàn)第20頁/共43頁二、B細(xì)胞功能檢測B細(xì)胞增殖能力的試驗(yàn)溶血空斑試驗(yàn)B細(xì)胞抗體形成功能的檢測體內(nèi)試驗(yàn)第21頁/共43頁(一)B細(xì)胞增殖能力的試驗(yàn)抗IgM細(xì)菌脂多糖SAC的SPA

B細(xì)胞增殖形態(tài)學(xué)3H－TdR摻入法第22頁/共43頁(二)溶血空斑試驗(yàn)1.原理：第23頁/共43頁2.方法學(xué)：經(jīng)典溶血空斑形成試驗(yàn)被動(dòng)溶血空斑試驗(yàn)

第24頁/共43頁3．臨床應(yīng)用與評(píng)價(jià)溶血空斑試驗(yàn)主要用于測定藥物和手術(shù)等因素對體液免疫功能的影響評(píng)價(jià)免疫治療或免疫重建后機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力。

第25頁/共43頁(三)

B細(xì)胞抗體形成功能的檢測

——酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法ELISPOT1.原理：第26頁/共43頁2．應(yīng)用與方法學(xué)評(píng)價(jià)：該方法既可檢測抗體分泌細(xì)胞，又可檢測抗體分泌量。優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時(shí)檢測不同抗原誘導(dǎo)的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞。第27頁/共43頁(四)體內(nèi)試驗(yàn)體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、多價(jià)肺炎鏈球菌菌苗等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價(jià)，判斷受檢者體內(nèi)B細(xì)胞的功能。第28頁/共43頁染色計(jì)數(shù)離心取上清測LDH或AKP離心取沉淀測活細(xì)胞熒光測發(fā)光強(qiáng)度測CPM值形態(tài)法酶釋法熒光法同位素法化學(xué)發(fā)光法三、NK細(xì)胞活性測定靶細(xì)胞溶解常用靶細(xì)胞:

K562細(xì)胞株第29頁/共43頁二吞噬細(xì)胞功能檢測技術(shù)

按其形態(tài)大小分為兩類：大吞噬細(xì)胞—單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)小吞噬細(xì)胞—中性粒細(xì)胞第30頁/共43頁一、中性粒細(xì)胞功能的檢測

細(xì)胞趨化功能的檢測吞噬和殺菌功能的檢測第31頁/共43頁(一)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能——趨化功能檢測1.原理：第32頁/共43頁2.方法：

瓊脂糖平板法

濾膜滲透法（Boyden小室法）第33頁/共43頁(二)吞噬和殺菌功能測定1．顯微鏡檢查法：第34頁/共43頁2.溶菌法第35頁/共43頁NBT還原試驗(yàn)

原理：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黃色）甲臜（紫黑色）3．NBT還原試驗(yàn)

第36頁/共43頁中性粒細(xì)胞NBT甲臜顆粒沉積于胞質(zhì)中第37頁/共43頁二、巨噬細(xì)胞功能檢測(一)炭粒廓清試驗(yàn)

正常小鼠肝中枯否細(xì)胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除10%炭粒。據(jù)此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁(炭粒懸液)，間隔一定時(shí)間反復(fù)取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。第38頁/共43頁(二)吞噬功能檢測

巨噬細(xì)胞對顆粒性抗原物質(zhì)具有很強(qiáng)的吞噬功能，常用雞紅細(xì)胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母細(xì)胞等作為吞噬顆粒，用斑蟊敷貼法收集人巨噬細(xì)胞或從腹腔滲出液獲得鼠巨噬細(xì)胞。第39頁/共43頁(三)巨噬細(xì)胞溶酶體酶的測定1．酸性磷酸酶的測定硝酸鉛法偶氮法2．非特異性酯酶的測定常用α-萘醋酸法第40頁/共43頁(四)細(xì)胞毒作用測定

用IFN-γ激活小鼠巨噬細(xì)胞，觀察其對125I-UdR標(biāo)記的DBA/2小鼠肥大細(xì)胞瘤P815