PAGEPAGE18食品毒理學實驗指導郭紅輝劉永吉編寫韶關學院英東食品科學與工程學院2012年9月實驗注意事項食品毒理學所開設實驗均要用到實驗動物，為保證實驗安全順利進行，特別提出以下注意事項，所有實驗人員務必認真閱讀，嚴格遵守。定，不得戲弄或者虐待實驗動物。課前預習實驗指導，熟悉實驗操作流程，撰寫預習報告。等意外事故發生；如有意外發生，馬上報告老師。實驗動物器官和尸體不要隨意丟棄，交由班級指定負責人集中處理。實驗結束后，清洗和整理好實驗用具，交由老師清點后方可離開。實驗一實驗動物的基本操作一、目的和意義毒理學研究需要用實驗動物來進行各種實驗，通過對動物的實驗觀察和分析來-掌握動物實驗基本操作是毒理學研究必備技能。二、實驗器材及試劑1、器材1.50.5mlEP管等2、試劑（1~苦味酸溶液（即２，４，６－三硝基苯酚的蛋白發生反應，可染成較為牢固的亮黃色。可用水，也可用一定濃度的乙醇來配制。（2）0.5%中性紅或品紅溶液,可染成紅色。三、內容（一）健康動物的選擇無論選擇哪種種屬品系的動物進行實驗，均要求選擇健康的實驗動物。健康動物檢查時要求達到：外觀體形豐滿，被毛濃密有光澤、緊貼體表，眼睛明亮，行動迅速，反應靈活，食欲及營養狀況良好。（二）實驗動物性別的鑒定動物性別不同對毒物的敏感性也不同，這可能與性激素、肝微粒體羥基化反應有關，也隨受試物而異。因此，要根據實驗要求選擇性別，一般實驗如對性別無特殊要求者，以選用雌雄動物各半。成年鼠直接觀察有無外露睪丸。家兔可觀察其陰部孔洞大小及其離肛門的距離。孔洞扁形略大，離肛門較近的為母兔；孔洞圓形而小，離肛門較遠的為公兔。對開眼后的仔兔和滿月幼兔鑒別公母時，右手抱定仔兔，腹部朝上，左手中指與食指夾住兔尾，拇指輕按，掰開后形的為公兔。（三）實驗動物的抓取方法以無名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。免咬傷，可帶上帆布或棉紗手套。采用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指緊捏鼠背皮膚，置于左掌心中，這樣右手可進行各種實驗操作。鼠背，抓住其肩胛上方，以拇指和食指環握頸部，另一只手托住臀部即可。兔的抓取方法用右手抓住兔頸部的毛皮提起，然后左手托住其臀部或腹部，讓其體重的大部分重量集中在左手上。（四）實驗動物的編號、標記方法0.1g5%。編號123456789。雙色涂染法是采用兩種顏色同時進行染色標記的方法。例如用苦味酸（黃色）染色標記作為個位數，用品紅（紅色）染色標記作為十位數。此法略嫌煩雜。剪耳法烙印或剪毛法號牌法植入芯片法采用獨特專利技術,2mm11mm的IMI-1000織內保持位置固定,,存或液體保存,即使經過幾十年的長期保存,仍然可以馬上讀取數據。（五）實驗動物的隨機分組法動物實驗時，常常需要將選擇好的實驗動物，按研究需要分成若干個組，分組時為了避免人為的因素影響常應用隨機數字表進行完全隨機化的分組。（六）實驗動物的被毛去除方法剪毛1）把剪刀貼近皮膚剪，不可用手提起被毛，以免剪破皮膚（2）（3）剪下來的被毛集中在一個容器內，勿遺留在手術野和操作臺周圍。拔毛脫毛（七）實驗動物染毒途徑和方法皮下注射皮下注射給藥是將藥液推入皮下結締組織，經毛細血管、淋巴管吸收進入血液循環的過程。作皮下注射常選項背或大腿內側的皮膚。操作時，常規消毒注射部位易擺動則表示已刺入皮下，再輕輕抽吸，如無回血，可緩慢地將藥物注入皮下。拔0.1-0.3ml/10g體重。皮內注射接種、過敏實驗等一般作皮內注射。先將注射部位的被毛剪掉，局部常規消毒，左4.5針頭穿刺，針頭進入皮膚淺層，再向上挑起并梢刺入，將藥液注入皮內。注射后皮膚出現0.1ml/次。肌肉注射小鼠體積小，肌肉少，很少采用肌肉注射。當給小鼠注射不溶于水而混懸于油11901/4,液.0.1ml/10g體重.腹腔注射3mm450.1-0.2ml/10g體重。靜脈注射兔：常用耳外緣靜脈；大小白鼠：一般為靜脈注射（左右二側的；小白鼠和大白鼠：一般采用尾靜脈注射，鼠尾靜脈有三根，左右兩側及背側各一根，左右兩側尾靜脈比較容易固定，多采用，背側一根也可采用，但位置容易固定。操作時先將動物固定在鼠筒內或扣在燒杯中，使尾巴露出，尾部用45～50℃的溫水浸潤半分鐘或用酒精擦拭使血管擴張，并可使表皮角質軟化，以左手拇指和食指捏住鼠尾兩側，使靜脈充盈，用中指從下面托起尾巴，以無名指和小指夾住尾巴的末梢，右手持注射器連4(1/2號細針頭，使針頭與靜脈平行（小于30℃四分之一處（2-3厘米）處進針，此處皮薄易于刺入，先緩注少量藥液，如無阻力，表示針頭已進入靜脈，可繼續注入。注射完畢后把尾部向注射側彎曲以止血。如需反復注射，應盡可能從末端開始，以后向尾根部方向移動注射。1常用實驗動物的最大給藥量和使用針頭規格動物名稱項目灌胃皮下注射肌肉注射腹腔注射靜脈注射小白鼠最大給藥量1ml0.4ml0.4ml1ml0.8ml使用針頭9(鈍頭)5(1/2)5(1/2)5(1/2)4大白鼠最大給藥量1ml1ml0.4ml2ml4ml使用針頭靜脈切開針6665鼠最大給藥量3ml1ml0.5ml4ml5ml使用針頭靜脈切開針6(1/2)6(1/2)75兔最大給藥量20ml2ml2ml5ml10ml使用針頭10號導尿管6(1/2)6(1/2)76貓最大給藥量使用20ml20ml2ml5ml10ml針頭10號導尿管7776蛙 淋巴囊注射 最大注射量1ml/只經口染毒：灌胃家兔等動物。小鼠、大鼠（或豚鼠）用輸血針頭或小號腰穿針頭，將其尖端斜面磨劑，用焊錫在針尖周圍焊一圓頭，注意勿堵塞針孔，即成灌胃針；亦可用燒成圓頭的硬質玻璃毛細管或特制的塑料毛細秋，作為導管。灌胃時將針按在注射器上，吸入藥液。左手抓住鼠背部及頸部皮膚將動物固定，右手持注射器，將灌胃針插入動物口中，沿咽后壁徐徐插入食道。動物應固定成垂直體位，針插入時應無阻力。若感到阻力或動物掙扎時，應立即停止進針或將針拔出，以兔損傷或穿破食道以及誤入氣管。3－4cm4-6cm0.2-1ml1-4ml1-5ml。其他途徑給藥：呼吸道染毒皮膚染毒：a.斑貼法；b.浸尾法（八）實驗動物生物材料采集和制備（八）動物常用采血方法大小鼠鼠尾采血法：剪尾法或尾靜脈采血45刀或剪刀)割去尾尖0.3-0.5cm，讓血液自由滴入盛器或用血紅蛋白吸管吸取，采血結束，傷口消毒并壓迫止血。也可在尾部作一橫切口，割破尾動脈或靜脈，收集血液100.1ml0.3～0.5ml鼠尾靜脈刺血法大鼠用血量不多時(僅做白細胞計數或血紅蛋白檢查78號注射針頭，刺入鼠尾靜脈，拔出針頭時即有血滴出，一次可采集10～50mm3期反復取血，應先靠近鼠尾末端穿刺，以后再逐漸向近心端穿刺。眼眶靜脈叢采血法采血者的左手拇食兩指從背部較緊地握住小鼠或大鼠的頸部(大鼠采血需帶上紗手套)，應防止動物窒息。當取血時左手拇指及食指輕輕壓迫動物的頸部兩側，使71ml注射器或長頸(3～4cm)硬質玻璃滴管(0.5-1.0mm)45℃的夾角，由眼內角刺入，針頭斜面先向眼球，刺入后再轉180度使斜面對著眼眶后界。刺入濃度，小鼠約4～5mm0.1-0.5mm，邊退邊抽。若穿刺適當血液能自然流入毛細管中，當得到所需的血量后，即除去加于頸部的壓力，同時，將采血器拔出，以防止術后穿刺孔出血。若技術熟練，用本法短20-25g的小鼠每次可采血200-300g腹主動脈或股動/靜脈采血法締組織，夾住動脈近心端，用尖頭手術剪刀，剪斷動脈，使血液噴入盛器。股動(靜)15-20g0.2-0.8ml，0.4-0.6ml。斷頭采血法采血者的左手拇指和食指以背部較緊地握住大(小)鼠的頸部皮膚，并作動物頭1/2-4/50.8～1.2ml;5-10ml。家兔耳緣靜脈采血法心臟采血法2.動物尿液采集代謝籠法：此法較常用，適用于大、小鼠。將動物放在特制的籠內。動物排便由于大、小鼠尿量較少，操作中的損失和蒸發，各鼠膀胱排空不一致等原因，都可5小時以上的尿液，最后取平均值。需采取少量尿液時，可提起小鼠，將排出的尿液接到帶刻度的容器內。導尿法：常用于雄性兔、狗。動物輕度麻醉后，固定于手術臺上。由尿道插入導尿管(頂端應用液體石蠟涂抹)，可以采到沒有受到污染的尿液。（九）實驗動物的處死及解剖脊椎脫臼法：多用于小鼠；右手抓住鼠用力向后拉，同時左手拇指與食指用力向下按住鼠頭，將脊髓與腦髓拉斷，鼠便立即死亡斷頭法：大小鼠；實驗者戴上棉綠紗手套，用右手握住大鼠頭部，左手握住背部，露出頸部，助手用剪刀在鼠頸部將鼠頭剪掉。小鼠處死法相同。急性大失血法可采用鼠眼眶動脈和靜脈急性大量失血方法使鼠立即死亡。擊打法右手抓住鼠尾，提起，用力摔擊其頭部，鼠痙攣后立即死亡。用小木錘用力擊打鼠頭部也可致死。麻醉致死法麻醉后急性放血法空氣拴塞法化學致死法吸入一氧化碳，大、小鼠在一氧化碳濃度為0.2-0.5%環境中即可致死。2.0mg/kg3.0-3.5ml/kg0.6ml/脈注入。開放性氣胸法作業606組，寫出計算過程和分組結果。畫出自己所領取實驗動物的標號示意圖。實驗二急性經口毒性實驗一、實驗目的：（一）通過本次實驗掌握經口灌胃技術，半數致死劑量的意義。（二）通過本次實驗學習半數致死劑量的計算及毒性判定。二、實驗器材及試劑1、器材帆布手套、橡膠手套、剪刀、大頭針、小鼠鼠籠、泡沫塑料板、棉簽、紗布、脫脂棉、小鼠灌胃針、1ml注射器等2、試劑（1）甲醇，梯度稀釋，濃度分別為75.0%、60.0%、48.0%、38.4%、30.7%和24.%三、測定方法：本實驗以灌胃方式測定甲醇的半數致死量（LD。50（一）實驗動物與分組：首選健康成年昆明種小鼠(8周齡，18g～25g)或大鼠(180g～220g)。3～5d況，并淘汰不健康或體重不符合要求的動物。本次實驗取體重18-25g的小鼠，實驗時，將小鼠稱體重、編號、按隨機分組原則，將實驗動物分成5組，每組8只。（二）劑量選擇：首先查閱與受試化學物結構及理化性質相近似的化學物的LD，以此值作為受試50化學物的預期毒性中值，即中間劑量組，再上下各推1-2個劑量組，進行預實LD約為7200mg/kgBW。但對于人，甲醇攝50入量超過4克就會出現中毒反應，誤服一小杯超過10克就能造成雙目失明，飲30在體內氧化生成甲醛和甲酸也都有毒性。各劑量組的間距可根據LD 計算方法要求按等比級數或等差級數安排。50本實驗用機率單位法計算LD，要求按等比級數排列，常用1：0.8，如甲醇的最5012000mg/kg12000mg/kg*0.8=9600mg/kg，依次類7680、6144、4915.23932.2mg/kg（三）受試化學物配制與稀釋溶劑：水溶性受試化學物以蒸餾水為溶劑配制成溶液。脂溶性受試化學物以吐溫-80、二甲基亞砜、植物油等配制。（三）受試化學物配制與稀釋受試物的稀釋事先設計的劑量分別稀釋配制為幾種不同的濃度的受試物溶液。例如本次實驗五個劑量組:20ml/kg等容量稀釋法D：設計的染毒劑量，mg/kgV：動物給藥量（相同單位體重體積）均為20ml/kgX：各組需配制的受試物溶液的濃度（mg/ml）D=12000V=0.2ml/10g(20X=600mg/ml依次類推：計算六個染毒動物組所需配制的受試物濃度第一組：600mg/ml；第二組：480mg/ml；第三組：384mg/ml第四組：307.2mg/ml；第五組：245.8mg/ml；第六組：196.6mg/ml根據以下公式計算各劑量組小鼠灌胃容量:小鼠灌胃容量Vml=體重（g）×20ml/1000g各劑量組小鼠染毒劑量（=0.8g/ml）:小鼠染毒劑量=V×各組的受試物濃度（mg/10ml)（四）灌胃方法：即深人至胃部，一般進針深度小鼠2.5～4cm，隨后將受試物溶液注入。如遇動10-20ml/kg（五）中毒體征和死亡情況觀察染毒后觀察和記錄中毒體征及出現的時間、死亡數量和時間及死亡前的特征。高劑量組動物的死亡常很快發生，染毒后應即刻密切觀察。根據觀察情況分析中毒特點和毒作用靶器官。觀察的項目包括：抽搐麻痹、運動失調、對外反應過敏或遲鈍；植物神經系統：瞳孔擴大或縮小、流涎或流淚；泌尿生殖系統：會陰部污穢、有分泌物、陰道或乳房腫脹；皮膚和毛：皮膚充血、紫紺、被毛蓬松、污穢；眼：眼球突出、結膜充血、角膜渾濁、血性分泌物；消化系統：腹瀉、厭食、LD50 計算：LD50，等。由于寇氏法較常用，并有計算簡便，結果較準確等特點，故推薦使用。1預備實驗（1）摸索上下限：即用少量動物逐步摸索出使全部動物死亡的最小劑量（Dm和一個動物也不死亡的最大劑量（Dn。2~3低劑量；如全不死，則加大劑量再行摸索，直到找出Pm=100%和Pn=0%的劑量，此兩量分別為上下限。（2）確定組數，組距及各組劑量①組數：一般5～8組，可根據適宜的組距確定組數，如先確定5組，若組距過大，可再增加組數以縮小組距。有時也可根據動物死亡情況來決定增減組數。②組距：指相鄰兩組劑量對數之差，常用“d”來表示。D不宜過大，因過大可使標準誤增大；也不宜過小，因過小則組數增多，各組間死亡率重疊造成實驗動物的浪費。組距大小主要取決于實驗動物對被試因素的敏感性。敏感性大者，死亡率隨劑量增加（或減少）而增加（或減少）的幅度大，組距可小些；反之，敏感性小者，死亡率隨劑量變化的幅度小，則組距應大些。上下限之間的距離可作為敏感性大小的標志。距離大，說明敏感性小；距離小，則說明敏感性大。一般要求d0.155，多在0.08～0.1之間。Xk限劑量的對數值為X1，組數為G，則：d＝（Xk-X1）/（G-1）④確定各組劑量：由X1逐次加d（或由Xkd值，再分別查反對數，即得出各組劑量（呈等比級數排列。（3）配制等比藥液，并使每只動物在給藥容量上相等（如0.5ml/20g。⒉正式實驗（1）實驗動物的選擇與分組①選擇原則：可根據不同實驗而選取動物，應選擇對被試因素敏感的動物。同時也應考慮動物來源，經濟價值及操作簡便等條件。LD50常用小白鼠進行實驗來測得。②分組原則：每組動物數必須多于組數。因為每組動物數如少于組數，就不能充分反映各組死亡率的差別。（如共8組，每組10只動物，高劑量三個組的死亡數分別為6、9、10，但如果每組只用6只動物，則高劑量三個組的死亡數可能都是6）③分組方法：見附錄，實驗對象分組法。首先，按性別將動物雌雄分開或各半混合編組，然后按體重分群，再隨機分組，為求使各組平均體重相等。（2）給藥、觀察死亡數、求出死亡率①給藥途徑：可據不同藥物及動物而定，小白鼠多用腹腔注射或灌胃法；也可靜脈注射。②給藥順序：宜采取間隔跳組方法。如共7組，先按2、4、6組順序給藥，然后逆行按7、5、3、1組的順序給藥。這樣可避免藥物放置過久或動物饑餓造成的偏向性誤差。而且當第3組給藥后，如第2組動物已經全死，則可省下第1組動物及780﹪動物的給藥容量可按個體體重或平均體重確定。溫度等生活條件，嚴防非被試因素引起的死亡。LD5095四、結果評價：LD50家標準或技術規范中的急性經口毒性分級標準（農藥的急性毒性分級）行毒性定級，判斷受試物的毒性大小。五、注意事項：灌胃時操作要避免損傷食道或誤入氣管正確捉拿動物，防止被咬傷且避免動物損傷灌入量計算和操作要準確，否則影響結果操作過程中要小心。六、實驗報告應包括以下內容：實驗動物的種屬。實驗動物體重和隨機分組情況。受試物的名稱、性狀等情況。受試物的配制和溶劑。描述實驗觀察的中毒表現和死亡情況等。LD50受試物的急性毒性分級、分級依據和結果評價。例：解磷定半數致死量(LD50)的測定124120％100量范圍。表1求解磷定LD的預試結果50組別小鼠(只)濃度劑量給藥容量死亡動物(只)死亡率（mg/ml）(mg／kg)（ml/10g）13153000.2237.51500.2333.75750.2431.8835.50.218～22g50510最好雌雄各半，各組按表210:8，給藥2表2求解磷定LD50的結果組別小鼠劑量對數劑量死亡動物死亡率(只)(mg／kg)(只)1103002.482102402.383101922.284101542.185101232.08計算方式 根據正式實驗各組死亡率按下列公式求出解磷定腹腔注射的LD50和可信限(P＝0.95)。0％，100％時，可按下列公式計算LD：50LD＝lg-1[Xm-i(∑p－0.5)]500％100％而又大于70％時，可按下列校正公式計算LD：503-Pm-PnLD＝lg-1[Xm-i(∑p－ )]50 4LD的標準誤：S50

＝i2n-1LD的平均可信限：LD±4.5S LD（P＝0.9。50 50 x50 50劑量組)，Pm為最大劑量組死亡率，Pn為最小劑量組死亡率，P為每組動物數。作業1、記錄注射不同劑量甲醇后小鼠的急性毒性表現，匯總后計算LD50及其95%可信限。295%可信限。灌胃劑量（g/kg）： 5.12 6.40 8.00 10.0 12.5死亡數/實驗動物數：1/10 2/10 4/10 7/10 9/10實驗三小鼠骨髓多染紅細胞微核試驗目的和意義微核試驗用于檢測受試物在哺乳動物所引起的染色體或原紅細胞有絲分裂器損傷，以確定該受試物有無誘變性。通過本次實驗學習和掌握小鼠骨髓多染紅細胞微核測定方法。原理正常細胞的有絲分裂的分裂中期，染色體均勻地排列在赤道板附近，到分裂后期便分成兩份，分別向兩極移動，并在末期分別形成兩個子細胞的核。如果由于某種化學物質的作用而使分裂期的細胞染色體受到損傷，在中期就會觀察到染色體斷當其它染色體分別形成子細胞核時，這些落后的斷片便獨立形成微核，如果紡錘體功能受損，也可產生微核。由上可見，微核的出現和染色體畸變有密切相關性，同時微核的觀察是在細胞的間期，不必分析中期相，這比分析染色體畸變要方便一些。進行骨髓細胞微核分析一般觀察紅細胞，記數嗜多染紅細腦中微核出現率。器材與試劑1、器材架、濾紙、電吹風機、染色缸、研缽、恒溫水浴箱、光學生物顯微鏡（鏡。2、試劑甲醇；吉姆薩儲備液：將1g66ml，轉移到燒杯內（或試劑瓶內55~602h60ml甲醇，混勻后置室溫，2~3瓶內備用（存放時間越長染色效果越好。吉姆薩染色液：實驗前取吉姆薩儲備液與磷酸鹽緩沖液（pH6.8）1:9混勻。磷酸鹽緩沖液（pH6.8）陽性對照物：環磷酰胺。操作步驟一、試驗動物及處理1、動物的選擇：選用小鼠，每組10只動物，雌雄各半。小鼠體重在18~20g，7~12w。2、染毒途徑：采用腹腔注射給藥。350mg/kg（空白對照。4、染毒次數和取樣時間：采用30h給藥法，即兩次給藥間隔24h，在第二次給藥后6h處死動物采集骨髓。二、骨髓液的制備和涂片脫頸椎處死小鼠，立即取出胸骨，除去胸骨上的血液和肌肉，橫向切斷胸骨，暴露骨髓腔擠出骨髓，小心地涂布于載玻片一端的胎牛血清液滴里，混勻涂片。三、固定15四、染色1015自然晾干。五、鏡檢可出現一個或多個微核。計數1000PCE中含微核的PCE數，并且計數200PCENCE的比值。六、結果分析與評價PCEPCE/NCE（0.6~1.<0.PCE形成受到嚴重抑制，受試化學物的劑量過大，試驗結果不可靠。實驗四小鼠精子畸形試驗1實驗目的掌握小鼠精子畸形試驗的基本技術要