胚胎工程實驗之體外受精第一頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日實驗二小鼠卵母細胞的體外受精第二頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日對畜牧業生產、動物生殖機理的研究及保護瀕危動物、治療人類的不孕不育癥等具有重要意義可望解決胚胎移植所需胚胎的生產成本及來源匿乏等關鍵問題。可利用IVM－IVF－IVC體外大規模生產高質量的胚胎，建立工廠化生產胚胎的成套技術，以大量生產質優價廉的胚胎，大大加速品種改良進程。體外受精的意義第三頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日能為動物克隆和轉基因等其他胚胎生物技術提供豐富的實驗材料和必要的研究手段充分挖掘優良公母畜的繁殖潛力評定家畜精子的質量第四頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日1978年英國第五頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日由于正常受精過程的完成需要一個完全成熟的卵子和一個獲得受精能力的精子，且其受精后需對其進行培養才能發育成為一個可移植的胚胎，因此，從廣義上講，體外受精技術又包含卵母細胞的體外成熟培養、精子的體外獲能、體外受精、受精卵的體外培養等多項密切相關的技術。第六頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第七頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日一、實驗目的熟悉雄鼠的生殖器官的結構特點；掌握從輸卵管上取成熟卵母細胞的方法；掌握從附睪尾部取精子的方法、精子的體外獲能和體外受精方案、受精率的觀察。第八頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日二、實驗器材和材料1.器材及藥品體視顯微鏡，手術器械，1mL注射器，膠頭滴管，口吸管，CO2培養箱，水浴鍋，移液器，槍頭，塑料培養皿，記號筆，血細胞計數板、載玻片、蓋玻片。0.1％透明質酸酶，卵母細胞操作液（M2），精子操作液和受精液（T6），胚胎培養液（CZB，有糖和無糖）、激素（PMSG和HCG），石蠟油。第九頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日2．實驗動物3-4周齡昆明系雌性小白鼠和8-12周齡雄鼠，自由采食飲水，控光一周以上，暗光時間20：00-6：00；光照時間6：00-20：00。第十頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日三、實驗內容第十一頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日1．體內成熟卵母細胞的獲取超排方法：15：00腹腔注射PMSG10IU/只小鼠。48小時后腹腔注射hCG10IU/只。注射hCG后14-15h，利用頸椎脫臼法處死小鼠（方法同實驗一），取輸卵管于M2操作液中，清洗兩次，在體視顯微鏡下用眼科鑷子撕開輸卵管壺腹部釋放出卵丘卵母細胞復合體團，用口吸管吹打幾次，把COC團分散開。第十二頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日IVM卵母細胞（小鼠）第十三頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日2．體外受精2．1取附睪尾部精子選取性成熟（>8周）昆明白雄鼠，已通過交配實驗證明其有受精能力，頸椎脫臼法殺雄鼠，打開腹腔，將附睪尾部和輸精管剪下，剔除脂肪，在實體顯微鏡下，用鑷子和針頭配合，擠出輸精管內精子。針頭刺破附睪尾部上皮，擠壓出精子（圖2-1）。第十四頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日大鼠（公）第十五頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第十六頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第十七頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第十八頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第十九頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日2．2精子的洗滌在小鼠上可省略（從附睪尾部取精子），但在大動物上必需（射出精液），洗滌可除去獲能抑制因子、卵黃、甘油等。第二十頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日2．3精子的獲能馬上收集精子團塊，置于1.5mL離心管中，加入1mL含10mg/mLBSA的T6，輕微振蕩幾次，使精子團分散開，用封口膜封口，于37.5℃，5％CO2，95％空氣，100％濕度的CO2培養箱內中孵育1.5h左右。第二十一頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日發展中的南京農業大學動物胚胎工程技術中心第二十二頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日2．4精液品質檢測主要檢測活力和密度，方法參考《動物繁殖學實驗教程》。第二十三頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日附：精液品質檢查精液品質檢查(semenqualitymeasurement)是為了鑒別精液質量的優劣。評定的各項指標，既是確定精液取舍、新鮮精液進行稀釋保存的依據，又能反映雄性動物飼養管理水平和其生殖器官的機能狀態。因此，常用作診斷公畜不育或確定其種用價值的重要手段，同時也是衡量精液在稀釋、保存和運輸過程中的品質變化和處理效果的重要判斷依據。第二十四頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日指標精子活力(motility)

精子活力是指精液中呈前迸運動的精子所占百分率，也稱活率。由于它與精子的受精能力直接相關，所以是評價精液品質的一個重要指標。通常在采精后，精液處理前、后，冷凍精液解凍后和輸精前進行檢查

精子密度每mL中精子的數目（細胞計數板）第二十五頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日精子頂體異常率(abnormalacrosomerate)：精子頂體在受精過程中具有重要作用，一般認為只有呈前進運動、且頂體完整的精子才具有正常受精能力。第二十六頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第二十七頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日精子畸形率(ASR)：凡形態和結構不正常的精子通稱為畸形精子。在正常精液中也有一定比例的畸形精子，但一般不會超20%。優質精液，精子畸形率不能超過如下數值:牛18%，水牛15%，羊14%，豬18%，馬12%，第二十八頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第二十九頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第三十頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日2．5體外受精將成熟的COC移入已經平衡2h的受精滴中（T6+20mg/mL），加入適量體積的獲能精子，使精子密度在1×106右，置于培養箱中孵育8h，觀察原核形成和第二極體排出，計算受精率。第三十一頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第三十二頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第三十三頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日體外受精質量的評定體外受精成功的判斷指標：精子穿透率原核形成率卵裂率囊胚率通過染色或胚胎培養第三十四頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第三十五頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日3．胚胎培養洗去精子，將胚胎換液于無糖CZB繼續培養。胚胎過阻斷之后（4－cell）換為含葡萄糖的CZB，換液時間在有1/3的胚胎到達4－cell后進行，大約在受精后36h－48h之間。在受精后24h、48h、72h、96h各觀察一次，記錄2－cell、4－cell、桑椹胚、囊胚的發育情況。第三十六頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第三十七頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第三十八頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日四、作業1．計算本實驗的受精率、卵裂率和囊胚發育率。鼠號卵數受精率卵裂率囊胚率第三十九頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日2．簡述實驗中的注意事項。3．簡述體外受精的步驟。第四十頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日THANKS!第四十一頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第四十二頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第四十三頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日

哺乳動物正常體內受精＋＝為了提高動物繁殖率，家畜體外受精技術在20世紀80年代初研究成功，并在近10年得到逐步完善。

體外受精（IVF）：指用經特殊處理的精子在體外使卵母細胞受精的技術。經IVF-ET所生的嬰兒稱試管嬰兒。精子受精卵卵子生殖細胞的收集精子卵母細胞

卵母細胞體外成熟培養受精受精卵的體外培養

精子體外獲能二、體外受精概述第四十四頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第四十五頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日發情周期觀察－超排－活體取卵－（或屠宰場卵巢－卵母細胞的體外成熟）采精－精液品質檢測－精子體外獲能體外受精（或ICSI）－胚胎質量檢測－胚胎移植－妊娠－分娩技術流程第四十六頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日卵子的收集和處理體內：（超排后從卵巢或輸卵管內）體外：屠宰場的卵巢本實驗用小鼠卵巢第四十七頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第四十八頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第四十九頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日Eggretrieval,detailview

第五十頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日未成熟卵母細胞第五十一頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日脫去卵丘的未成熟卵母細胞第五十二頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日GVBD第五十三頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日成熟的卵母細胞第五十四頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日IVM卵母細胞（小鼠）第五十五頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日放射冠透明帶卵質膜卵母細胞極體132第五十六頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第五十七頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第五十八頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日精子入卵的三道屏障：擴展的卵丘透明帶卵質膜弱精、畸精、少精癥患者的精子很難穿越三道屏障第五十九頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日卵巢卵巢大多呈卵圓形，都成對存在。由于各級卵泡及排卵后出現的一系列變化，致使牛、豬卵巢表面凹凸不平。卵巢位置是半游離的，系于卵巢系膜上。豬：青年豬為橢圓形，較小；多胎次后呈葡萄串狀。第六十頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日卵巢為實質器官，實質為各級卵泡，包括原始卵泡、初級卵泡、生長卵泡和成熟卵泡。原始卵泡數量很多，但能成熟的卵泡很少，絕大部分退化成為閉鎖卵泡。成熟卵泡排出卵細胞后，形成紅體，隨后形成黃體。黃體退化后由結締組織填充，而成為白體。第六十一頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日卵泡發育和排卵卵巢皮質部表層聚集著許多原始卵泡，由一個卵原細胞和周圍的單層扁平卵泡細胞組成。成熟：隨著卵泡的發育，經過初級卵泡、次級卵泡、生長卵泡和成熟卵泡階段，卵原細胞經過初級卵母細胞、次級卵母細胞，最終發育為卵子，由卵巢排出。第六十二頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日黃體及白體第六十三頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日子宮子宮是胎兒生長發育和娩出的器官。子宮(uterus)大部分位于腹腔，少部分位于骨盆腔。背側為直腸。腹側為膀胱，前接輸卵管，后接陰道，借助于子宮闊韌帶懸于腰下腹腔。子宮角－－子宮體－－子宮頸第六十四頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日牛的子宮第六十五頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日豬的子宮第六十六頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日2.卵子發生卵子是受精的基礎，作為配子的一方，在卵泡中逐漸發育成熟。精子：提供遺傳物質卵子：提供遺傳物質，提供支持早期胚胎發育的營養第六十七頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日2.1卵子形態結構哺乳動物的卵子為圓球形，其直徑大小因所含的卵黃量不同，變異范圍較大，透明帶內卵黃的直徑為80－200um，為精子體積的1萬倍。家畜卵的直徑一般小于185um，牛為120－140um，綿羊140－185um，豬120－170um。第六十八頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日雌性生殖細胞的分化、增殖、成熟全過程稱為卵子發生(oogenesis)。卵子發生起始于胚胎早期，由原始卵原細胞經過有絲分裂、減數分裂最后成為單倍體的卵細胞，持續時間很長，一般在初情期以后開始，至受精過程中才能完成。第六十九頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日2.2卵子發生特點卵子發生和精子發生的過程很相似，都要經過增殖期、生長期和成熟期三個階段，但與精子發生相比也有許多不同之處。首先，卵原細胞經過有絲分裂的增殖形成初級卵母細胞，初級卵母細胞經過兩次減數分裂，每次分裂均生成大小不等的兩個細胞，小的稱為極體。多余的染色體被排出，最后形成一個成熟的卵子。第七十頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日其次，哺乳動物的卵原細胞分裂形成初級卵母細胞都是在胎兒出生以前或出生后不久完成的。在動物性成熟以前，卵母細胞不再增長，停留在第一次減數分裂前期。到性成熟以后，每個性周期都會有部分卵母細胞發育，但多數卵母細胞在發育過程中退化，只有少數卵母細胞發育到成熟并排卵。第七十一頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日卵母細胞在生長發育過程中要積累大量的營養物質和遺傳信息，為胚胎發育提供營養和信息。盡管哺乳動物的胚胎是在母體子宮內發育，可以直接吸收母體的營養物質，不像鳥類、兩棲類、爬行類動物的卵需要存貯大量的卵黃物質，但一些母源性的合成還是必需的。第七十二頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第七十三頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第七十四頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第七十五頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日三、卵的采集及體外成熟（實驗）

1.卵母細胞的離體采集母畜屠宰后，在30min內取出卵巢，放入盛有滅菌生理鹽水或PBS的保溫瓶內（25－35℃）中，在3h內送回實驗室，然后按照下述方法進行回收。①卵泡抽吸法：用注射器套上12－16號針頭，保持一定負壓，從卵泡的側面刺入，一次進針可抽吸卵巢皮質的多個卵泡。②卵泡解剖法：用手術刀片將卵巢切為兩半，去掉中間的髄質部分，露出卵泡，然后用刀片劃破卵泡，在培養液中反復沖洗，采集其中的卵母細胞。

（一）卵母細胞的采集方法第七十六頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日2.卵母細胞的活體采集因從屠宰場收集得到的卵巢無法知道其系譜，且其種質一般相對較差，所以卵母細胞的活體采集是通過體外受精技術生產良種胚胎的一種主要途徑。如今，活體采卵已成為當今應用體外受精和胚胎移植的一項關鍵技術。①腹腔鏡法：②B型超聲波法：第七十七頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日Eggretrieval,ultrasoundimage

第七十八頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日GIFTprocedure,gameteintrafal-lopiantransfer,laparoscopy配子輸卵管內移植（GIFT）第七十九頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日

（二）卵母細胞的篩選

只有周圍包被著完整卵丘（A級）或部分卵丘脫落（B級）、胞漿均質并充滿于透明帶內的卵母細胞才能進行成熟與胚胎發育的培養。第八十頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日

（三）卵母細胞的體外成熟方法

37-39度，5％二氧化碳，100％濕度

1.成熟培養液的選擇基礎培養液TCM199中的核苷、黃嘌呤和次黃嘌呤等對卵母細胞核成熟有抑制作用的成分濃度較低，培養的效果相對較好。體外成熟培養卵母細胞還要在基礎液加入一定濃度的血清（5％－10％的FCS或ECS）和促性腺素（0.1－1.0μg/mlFSH和5－10μg/mlLH等）等成分。

2.成熟培養的時間對大多數家畜來講，卵母細胞的成熟培養時間一般采用22－24h，但是也要依據動物而定。第八十一頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日3.成熟培養的溫度和氣相環境溫度：目前，除人和嚙齒類動物的卵母細胞體外成熟仍采用37℃外，牛、豬、羊和馬等家畜的卵母細胞成熟培養溫度均采用38－39℃。氣象環境：

CO2的濃度：應根據培養液中的碳酸氫鹽來定。由于目前培養液中NaHCO3濃度多為25－30mmol/L，故一般都采用5％的CO2。

4.成熟培養的系統大致可分為三大類。①開放培養系統：將1－2ml成熟培養液直接置于平面皿內或五孔培養板內，然后放入50－200枚卵母細胞進行培養，上面不覆蓋石蠟油。第八十二頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日

②微滴培養系統：將成熟培養液先在組織培養皿中做成50－500μl的微滴，上覆石蠟油，然后將卵母細胞置于其中培養。在一般情況下，這種培養液用在卵母細胞數量特別少的情況下采用。③密閉培養系統：將卵母細胞置于含有1－2ml成熟培養液的試管中，加蓋膠塞，然后在培養箱或恒溫水浴中培養；如若采用培養皿或微滴培養，則可將其裝入一個密閉的塑料袋內。第八十三頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日IVF,invitrofertilization,process

第八十四頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日受精是兩性配子(精子和卵子)相互作用，結合產生新的個體即合子(zygote)的過程。

通過受精，單倍體的雌、雄生殖細胞共同構成雙倍體的合子(又稱受精卵)，合子是新生命發育的起點。哺乳動物受精部位：輸卵管壺腹部。第八十五頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日有極少數的精子到達輸卵管壺腹部。主要是由于精子從射精部位到達受精部位需要闖過三道關卡，即經過三次篩選：第一道關卡——子宮頸。第二道關卡——子宮內膜腺。第三道關卡——輸卵管壺腹部和峽部的連接部。第八十六頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第八十七頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日剛射出的精子不能穿入卵子，而只有在雌性生殖道內度過一段時間之后，才獲得受精能力，稱為“獲能”(capacitation)。三、精子獲能第八十八頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日精子獲能后，能釋放出一系列水解酶，可將包圍在卵子周圍的細胞和生物大分子物質(蛋白質和黏多糖)溶解出一條通路，便于精子進入卵母細胞。獲能過程先在子宮內進行，最后在輸卵管內完成。第八十九頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日頂體反應(acrosomereaction)：包裹精子頭部的質膜、頂體外膜融合和破裂，釋放頂體內含物的過程。這一反應是精子與卵子融合前必須經歷的反應之一，也是精子獲能后的必然結果。四、頂體反應第九十頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第九十一頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日受精過程始于精子與卵子相遇，兩性原核合并形成合子時結束，分為五個步驟：精子穿過放射冠精子穿過透明帶精子穿過卵質膜原核形成配子配合五、受精的過程第九十二頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日原核形成精子入卵后不久，頭部開始膨大，核疏松，核膜消失，失去固有的形態，最后在疏松的染色質外又形成新的核膜，這種重新形成的核叫雄原核。同時卵母細胞減數分裂恢復，釋放第二極體。卵中的染色質外又形成新的核膜，稱雌原核。第九十三頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第九十四頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日配子配合雄原核和雌原核經充分發育，逐漸相向移動。在卵子中央，核仁和核膜消失，兩原核緊密接觸，然后迅速收縮，染色體重新組合，并準備進行第一次有絲分裂，形成一個稱為“合子”的單細胞胚胎。第九十五頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第九十六頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第九十七頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第二節體外受精一、概述二、精子的制備及獲能三、卵的采集及體外成熟四、體外受精的方法五、體外受精質量的評定六、早期胚胎的體外培養七、影響體外受精的因素第九十八頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日1998年我國首例試管嬰兒誕生10周年時，張麗珠與鄭萌珠在一起。北京醫科大學第三醫院第九十九頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日2.歷史1978年7月25日，第一例試管嬰兒LouiseBrown在英國誕生，這是體外受精技術走向全面應用的標志性事件，是醫學和生物學上的一次偉大的革命。而早在1878年，德國科學家Schenk就開始進行哺乳動物卵子體外受精的嘗試。1890年，Heape用人工授精和體外受精技術研究兔的胚胎移植，胚胎可成功發育直至降生。第一百頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日

直至20世紀40年代，世界上也只有為數不多的科學家能成功的進行哺乳動物體外受精試驗。美國的Pincus和日本的Yamane是這時期的代表。美籍華人張明覺在1945年曾成功的進行了兔體外受精，但在此后的5年里沒有能再重復出這一結果。這個時期的體外受精工作主要建立在經驗基礎上。第一百零一頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日1951年，Chang和澳大利亞的Austin幾乎同時發現只有在雌性生殖道內停留一段時間的精子才能成功的與卵結合，進行體外受精。精子獲能現象的發現是體外受精史上的一個里程碑。1959年，Chang利用體內獲能處理的精子進行體外受精實驗，獲得世界上首例“試管動物”——試管兔，為哺乳動物體外受精工程奠定了基礎。第一百零二頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日

1963年，Yanagimachi和Chang首次報道了成功進行精子體外獲能的實驗（金黃倉鼠）。1970年，Mukherjee和Cohen，小鼠。1978年7月25日，第一例試管嬰兒LouiseBrown在英國誕生（Steptoe和Edwards），這是體外受精技術走向全面應用的標志性事件，是醫學和生物學上的一次偉大的革命。第一百零三頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日1989年，陳大元等首次成功進行大熊貓精子體外獲能，體外獲能的大熊貓精子能與金黃地鼠卵子相互作用。1990年，Miller和Ax相繼進行了美洲虎和美洲豹的體外受精，并于同年獲得美洲虎體外受精后代。第一百零四頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日80年代以來，由于對胚胎需求量的加大，促進了家畜體外受精的研究，牛、羊、豬等相繼獲得了成功，國內在80-90年代也在家畜上取得了成功。

現已將卵母細胞體外成熟—體外受精—早期胚體外發育，甚至冷凍保存結合在一起，建立工廠化生產胚胎的成套技術，以大量生產質優價廉的胚胎。第一百零五頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日與人工授精相比，體外受精所需精子數減少，精液利用率提高。第一百零六頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日二、精子的制備及獲能

1.取精第一百零七頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日大鼠（公）第一百零八頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日2.精子的分離與制備是IVF的一個關鍵環節精液中的精子獲能抑制因子冷凍精液中的防凍劑和蛋黃等成分

影響和干擾受精的完成過多的留在受精液中的死精子

第一百零九頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日①懸浮法（swimup）：是篩選高活力精子最為有效的一種方法。②玻璃棉（glasswool）過濾法：該法可有效地濾除品質較差精液中的死精子，大大提高精子的受精穿透率。

方法：第一百一十頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日③BSA/哌可（Percoll）密度梯度離心法：采用不連續的BSA密度梯度可以分離得到形態正常的高活力精子。④離心洗滌法：對于精子活力較好的精液可采用直接離心洗滌法制備用于體外受精的精子。第一百一十一頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日3.精子獲能原理任何可導致精子被膜蛋白脫除，質膜穩定性下降，通透性增加和Ca2+

內流的處理方法，均能誘發精子的獲能。精子獲能后發生一系列明顯變化，代謝活動顯著增強，攝氧量增加2-4倍，運動速度加快，頭部膨大，極易發生頂體反應。第一百一十二頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第一百一十三頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第一百一十四頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日母畜生殖道內的獲能因子中和精子表面的去能因子精子質膜的膽固醇外流Ca2+進入精子內部膜的通透性增加獲能完成

膜蛋白重新分布，膜的穩定性下降cAMP濃度升高激活腺苷酸環化酶抑制磷酸二酯酶第一百一十五頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日

體內獲能：把精子送入結扎的子宮角或輸卵管中孵育

①與血清白蛋白的溶液長時間孵育：原理是血清中白蛋白具有很強結合膽固醇和鋅離子的能力，可除去質膜中部分膽固醇和鋅離子，改變精子質膜的穩定性，導致精子獲能。②用高離子強度溶液處理精子：精子表面的去能因子（被膜蛋白），當用高離子強度溶液處理精子時，將從精子的表面脫落，從而導致精子獲能。③與含有卵泡液的培養液進行孵育：

4.精子體外獲能的方法第一百一十六頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日④使用鈣離子載體A23187：

直接誘發Ca2+進入精子細胞內部，提高細胞內的Ca2+濃度，從而導致精子獲能。⑤使用肝素：是一種高度硫酸化的氨基多糖類化合物，當它與精子結合后，能引起Ca2+進入精子細胞內部而導致精子的獲能。是一種接近于體內獲能的生理性方法，已經成為動物體外受精應用最廣的一種精子獲能方法。第一百一十七頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日四、體外受精的方法

體外受精的完成需要一個有利于精子和卵子存活的培養系統。①微滴法：是在塑料培養皿中用受精液做成20－40μl的微滴，上覆石蠟油，然后每滴放入體外成熟的卵母細胞10－20枚及獲能處理的精子（1.0－1.5）×106個/ml，在培養箱中孵育6－24h。第一百一十八頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日②四孔培養板法：每孔加入500μl受精液和100－150枚體外成熟的卵母細胞，然后加入獲能處理的精子（1.0－1.5）×106個/ml，而后在培養箱中孵育6－24h。

第一百一十九頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日五、體外受精質量的評定體外受精成功的判斷指標：精子穿透率原核形成率卵裂率囊胚率通過染色或胚胎培養第一百二十頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第一百二十一頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日第一百二十二頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日六、早期胚胎的體外培養

對于一些采用非手術法將胚胎移植的家畜來說，體外受精后的早期胚胎必須在體外培養至桑椹胚或囊胚階段才能移植；而對于那些采用手術法移植胚胎的動物，將受精卵培養成囊胚再移植，亦有可能提高移植妊娠率，因體外受精的胚胎并不是都能發育到囊胚階段。因此，早期胚胎的體外培養是胚胎體外生產技術中非常關鍵的一個環節。第一百二十三頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日（一）胚胎體外培養的發育阻斷隨著胚胎的發育，合子的基因開始啟動轉錄，其代謝活動逐步由母源的mRNA控制向合子本身的mRNA控制過渡，在這一過渡時期，胚胎對所處的環境條件特別敏感，稍有不適便表現出不可逆的發育阻斷。（門檻）第一百二十四頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日在進行哺乳動物胚胎體外培養時，若胚胎所處的條件不當，就會出現體外發育阻斷，即早期胚胎停頓在某個特定時期，甚至不能發育。在體內正常的生理條件下，胚胎從輸卵管和子宮腺體壁吸取營養，保證其正常的發育。體外模擬動物體內的環境條件第一百二十五頁，共一百三十一頁，2022年，8月28日

發育阻斷的出現時間與合子基因啟動的時間有關，而且發育阻斷的出現與否也是胚胎質量和培養條件相互作用的結果，在一定的培養條件下，某些特定品系的多數胚胎不表現發育阻斷，而通過改善培養條件亦能提高通過發育阻斷的胚胎比率。小鼠：2細胞牛羊：8-16