實習二細胞存活曲線測試與結果分析一、目的要求實習目的是了解克隆形成法檢測細胞存活曲線實驗方法的原理與基本步驟，熟悉細胞存活分數與受照劑量（Gy）之間的劑量一效應關系，以及與存活曲線結果分析處理有關的軟件使用，掌握細胞存活曲線的測試、繪制與結果分析的正確方法。具體要求：1,計算細胞接種效率PE；2,應用SPSS軟件計算單擊多靶模型下不同的n和k值，正確閱讀運算結果；3,根據實際獲得的n和k值，進一步計算出D、Dq和D值，以及增敏比SER；4,利用EXCEL軟件計算出不同劑量照0 37射下細胞的理論存活分數預測值，繪制存活分數預測值與照射劑量間的劑量效應曲線。二、 實驗原理放射生物學中細胞死亡是指細胞喪失完整增殖能力的一種死亡。當細胞受到電離輻射照射后，受照細胞可呈現“間期死亡”，或曰即刻死亡，也可能呈現為“增殖性死亡”，即受照細胞形態上仍然保持完整，而且有能力制造蛋白質、合成DNA，甚至還能再經過一次或n次有絲分裂后，才突然變性死亡。鑒于上述細胞死亡定義和照射后細胞死亡的實際情況，細胞放射生物學通常采用細胞克隆（集落）形成試驗來檢測照射后細胞的存活狀況。細胞克隆是在體外培養時由一獨立的單個健康存活細胞直接分裂增殖而形成的細胞群體。在計數克隆數目時，通常把含50個以上細胞的克隆計為一個細胞集落，代表一個存活細胞。在描述細胞存活分數（SF,survivalfraction）與電離輻射吸收劑量（Dose,Gy）間的定量關系時，通常有單擊單靶和單擊多靶兩種模型。而哺乳類細胞受照后存活曲線多近似地符合單擊多靶模型。根據模型對原始數據進行擬合分析可以獲得細胞存活曲線的數學表達式及其具有生物學意義的一些參數。例如在單擊多靶細胞克隆存活模型中，Dq值的大小反映細胞抵抗電離輻射修復亞致死損傷的能力。因此電離輻射細胞存活實驗就是要通過檢測與擬合細胞存活曲線，獲得諸如D、Dq、k和n等一系列參數，從而根據這些參數對細胞的放射敏感性作出定0量的評價。三、 細胞存活曲線實驗的基本步驟

細胞準備與照射 細胞照射前，取體外培養處于對數生長期的人宮頸癌細胞HeLa細胞，用0.125%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，計數細胞濃度。設假照射對照組和0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0Gy7個照射組，每組設3個平行實驗瓶。于25cm2培養瓶中，按劑量分組每瓶分別接種細胞100、200、400、1000、2000、4000、8000、16000個細胞，于37°C,5%CO下正常培養。2接種6-12小時后細胞已貼壁生長，將培養細胞轉移至鉆源室接受照射處理。其中，假照射對照組細胞不接受照射處理。rMlianuH^Huniwi- hl rMlianuH^Huniwi- hl 尋 ￡0imy; W細胞培養、克隆計數與平均存活分數(SF)的計算將接受照射后的細胞放回細胞培養箱繼續培養，每三天更換新鮮培養液一次。待培養至10-14天后棄去培養基，用0.5%結晶紫染色貼壁細胞。計數并記錄不同照射劑量下各組培養瓶中細胞存活克隆個數。根據假照射處理組細胞克隆形成數目，計算細胞接種效率(PE)；各照射處理組細胞存活分數(SF)為各組細胞克隆形成的平均數除以相應細胞接種數與接種效率的乘積。接種/(圉採種的細胞數細胞存活分數(SF)與輻射劑量之間數學模型的建立哺乳細胞接受不同劑量的電離輻射照射后，細胞存活的規律大多是符合單擊多靶細胞存活模型，即SF=1-[1-EXP(-k*D)**n]。根據實驗實測細胞存活數據進行該數學模型的非線性回歸擬合分析，可獲得單擊多靶細胞存活模型的一系列有意義的參數，如k、n、D、D和Dq。其中，k為細胞存活曲線的鈍化常數,0 37其值可由擬合曲線方程直接給出；n稱外推數，代表理論上的靶數目，數值大小也是由擬合方程直接給出。D、D和Dq是根據k、n值演算出來的，D稱為平均0 37 0致死劑量，是理論上使每個細胞平均被擊中一次所需要的輻射劑量，數值上D0=l/k；Dq稱為準閾劑量，表征修復亞致死損傷的能力，即克服單擊多靶曲線中“肩寬”的劑量，數值上Dq=lnnxD；D是細胞存活分數為37%時相應的輻0 37射劑量，在單擊多靶模型中D=D+Dq。細胞存活單擊多靶模型(下圖)的表37 0達式為：SF=l-(l-e-kD)nSPSS軟件對單擊多靶模型的數學擬合，求出模型中k和n參數值大致步驟如下：計算、整理不同輻射吸收劑量D下細胞的平均存活分數SF(校正接種效率后的平均存活分數，這是第一步)，制成劑量D與存活分數SF的二維表格；啟動SPSS軟件，定義變量名D和SF、字段寬度以及小數點后位數，將SF顯示精度定為小數點后4位數，并輸入D和SF的原始數據；選擇SPSS軟件中非線性回歸(Nonlinearregression)窗口，將SF設置為因變量(Dependent)，數學公式表達模型中輸入l-[l-EXP[-k*D]**n],同時將模型參數k和n迭代的起始值分別設置為0.0001，同時將模型參數k和n數值各自限制在大于或等于0.0001以內，保存上述分析條件；迭代擬合的算法方式選擇levenburg-Marquadt,為繪制存活曲線圖方便，顯示項中選擇根據擬合方程計算出的細胞存活分數的理論預測值；執行運算并顯示出SPSS特有的結果文件。在運算結果顯示文件中有不同迭代過程剩余的殘差平方和、根據l-[l-EXP[-k*D]**n]擬合后的最終優選k和n參數值、以及k和n的統計學顯著性檢驗概率等。最終優選的k和n參數值最為重要，是我們模擬計算的目的。此節是本次實驗的重點與難點，有關詳細過程可參考六、SPSS軟件使用指南參考。單擊多靶模型中D、Dq和D值，以及增敏比SER的計算0 37根據最終優選的k和n參數值，我們可以進一步計算出D0,D37和Dq，其相互之間的關系式如下：SP= 1—<1— 丄丄h—1IJQ丄=—1n11x-Z%+同一細胞株接受不同因素（如乏氧、增敏劑等）處理后再行照射，細胞存活曲線及其參數會發生變化，根據這些參數的變化我們還可進一步計算出增敏比（sensitivityenhanceratio,SER），SER增敏比反映細胞放射敏感性的不同及其變化。SER一般大于或等于1,SER越大說明經該試劑處理或缺氧后對輻射表現出更加敏感。SER=Dq（未接受化學處理或有氧情況下對照組）/Dq（接受化學處理或無氧情況下處理組）有研究表明，實體瘤細胞因缺血缺氧而表現出腫瘤細胞的內質網應激。Tun（衣霉素）具有抑制細胞內糖蛋白的糖基化修飾，從而導致內質網應激的發生。本次實習是利用Tun和另一種內質網應激試劑DTT一起對腫瘤細胞株HeLa細胞進行預處理，再行電離輻射照射。因此本次實驗我們要求同學利用附后的實驗結果，對內質網應激是否具有增強輻射敏感性的作用提出評價，另外如若要做出此實驗結論時您還希望要做的進一步補充實驗是什么，請說明為什么。利用EXCEL軟件對細胞存活曲線的繪制 最終優選的k和n參數值后除了可以進一步計算單擊多靶模型中D、Dq和D值以及增敏比SER外，我們還要0 37求同學利用k和n參數值回代到該模擬公式中，對不同輻射劑量D下的存活分數進行理論預測，然后利用理論預測的存活分數SF值與實際給予的輻射劑量D之間繪制一條平滑的存活曲線。繪制過程大致步驟如下：啟動EXCEL軟件；輸入不同劑量值D；fx欄輸入=l-POWER[(l-EXP(-k*D),n]公式，其中k和n值換成來自SPSS模擬方程的計算結果，運算各劑量組細胞存活分數預測值；根據各組劑量值D與細胞存活分數SF預測值建立數據二維表；啟動繪圖XY散點標準模式，輸入標題、縱橫軸名稱【如HeLa細胞伽瑪照射后存活曲線單擊多靶模型圖、SF、Dose(Gy)】，去掉網格線、圖背景陰影、圖例和線框；點擊Y軸坐標軸，選刻度項，修改最小刻度0.01，最大刻度10，主要刻度10，次要刻度10，數軸交叉于0.001，選對數刻度；點擊各組各點，選數據系列格式，線型選自定義，線形平滑；圖幅大小設置5X20。獲得曲線圖之后，我們也可以在不同預測曲線上添加出實測存活分數值，同學們由此可觀察到理論預測值與實際值之間的真實差異，這種差異也可以反映在運算結果顯示文件中顯著性檢驗分析上。四、實習作業演算練習，根據以下Tun和DTT組數據計算各自增敏比(SER)并作圖。cellseedingCTRsurvivalcellCTRmeancellTunsurvivalcellTunmeancellDTTsurvivalcellDTTsurvivalcellDosenumbernumbernumbernumbernumbernumbermean0600411390300060042742736506004424274424204323660.56002833622930.56003243493160.560021727528033029030011000322344353110002023803011100028827132735032432624000344492511240003574084582400034234860150054650568000260305300680002333242986800020323228130336332081000088122169

810000810000112851008100009498154120172147五、SPSS軟件使用指南參考:下面以原始數據進行1-[1-EXP[-k*D]**n]非線性回歸方程擬合為例詳細講解SPSS軟件的使用。照射劑量與平均細胞存活分數原始數據整理如下：組別Dose(Gy)平均（SF）00.00計算PE用10.001.0022.000.7034.000.3046.000.1058.000.02第一步：啟動SPSS,定義變量名，并把SF顯示為精度4位數，便于和擬合數據比較！！其中定義變量名非常關鍵JDIX]FileEditViewQa斯TransformArtalyaeGraphsUtilitiesWindowHe^p-|O|X|囲JDIX]FileEditViewQa斯TransformArtalyaeGraphsUtilitiesWindowHe^p-|O|X|囲Untitled-SPSSDatdEditor凰UnUkd-SPSSDataEditorFileEditViewDataTransformAnalyseGraphsUtiMiesWindowHelp色副昌I團討“曰吋州刊罰目圭|珂舸@|varvarvar土|wi1.oooo22.00.700034W300046.001.10?58O0f.0200bitaVie<^VariableView/|—?止SPSSProcessorisready第二步： 、 、激活Analysis菜單選Regression中Nonlinear...項，彈出NonlinearRegression對話框，依次進行如下圖中操作，其中ModelExpression的選項非常關鍵,本例為1-(1-EXP(-k*D))**N

第三步：點擊上圖中Parameters,出現下面的對話框,進行如下圖的設置:NonlinearRegression:ParameterConstraints0.0001N(O.DQ01)_d~l_J丄JIA0.C0O1IJ_1JDob刷Chancje|Berndve|色dd赳口nlinearRegresfiion:ParameterlZonfi：l:raini-?Fararn&terc:[kiO.DCiC-i)LUnconstrained0.0001N(O.DQ01)_d~l_J丄JIA0.C0O1IJ_1JDob刷Chancje|Berndve|色dd赳口nlinearRegresfiion:ParameterlZonfi：l:raini-?Fararn&terc:[kiO.DCiC-i)LUnconstrained c?GDefineparameterconstraint:乏L^「/JalSi_14i5161JjE11]'2]2|01.11JDeletfiff'.k>=0.0001AddChange「RerTiove第四步：打開限定條件對話框后，依次進行如下圖的設置，至于為什么要進行這種限定，以及這樣限定的合理性，簡單解釋:k肯定大于0,N也肯定大于0,所以就設置他們都大于一個很小的數字吧，這樣設置的巧妙性在于避免SPSS擬合過程中出現諸如（-3廠2.5這樣的死步驟。給好限定條件后，會跳出一個框子提醒你什么什么什么，不管他，繼續望下走2SJ-SequentialQuadraticP/ogr￡nnming—MswinfrurnrSteplirri十廠|d血◎忙:FunclicnpreciaoTr臥!2SJ-SequentialQuadraticP/ogr￡nnming—MswinfrurnrSteplirri十廠|d血◎忙:FunclicnpreciaoTr臥!iTEnfirvltestep|lE+20jJLevenbefg-MarquadtMaximumitgration監Sum^af^s^uaiesconvergence:ParameJetconvergencerBootstrapestimatesolstandardeiroiEstimationMethod「SequentialquadraticpiogrsmmingjLeverberg-MarqLjardtjlE-3_^J|IE8ContinueCancelHelp|顯示項中選擇根據擬合方程計算出的細胞克隆理論存活分數預測值；迭代擬合的算法方式選擇levenburg-Marquadt,保存各種所選條件等NonlinearRegression:Options第五步：回到擬合界面對話框后,依次進行下圖操作，目的是根據擬合方程顯示理論預測值，其中擬合算法很關鍵,請一定要按照圖中所示進行，最后點擊OK。一切結果就顯示出來啦！！

ConstrainedNonlinearRegressionAllthederivativeswillbecalculatednumerically.Thefollowingnewvariablesarebeingcreated:NameLabelPRED_PredictedValuesIterationResidualSSkN0.1.5885643726.000100000.0001000001.1.4326928450.000100000.0102676592.1.2644240765.000100000.0322631473.2.2460533309.000100000.0406662214.1.2353237999.000550799.0585760005.1.2343114615.000749210.0652734846.1.2310963020.001052919.0682917917.1.2267676825.001668720.0742292088.1.2253204323.001932692.0710710089.1.2252782354.0105250191.2114927788.007972194.12351152511.1.2072941880.007258942.10589198312.1.2037004224.008892185.11406220013.1.1849657836.020745415.16325923814.1.1678978737.036031833.21724645515.1.1359764487.073514715.34122793516.1.0696285850.177899360.68329900517.1.0193661970.3970542741.4088079618.1.0192417786.3931284801.3972888719.1.0187180868.3790873691.3614591320.1.0180956915.3717613231.3525710321.1.0160190997.3640753701.3850687422.1.0126064378.3751342921.5188111423.1.0059547114.4289360571.9034437224.1.0019056787.5007576152.3997357725.1.0011632693.5290739082.6347789226.1.0006871616.5469015662.8271744427.1.0003546795.5574224162.9926598528.1.0002842715.5604100253.0673789329.1.0002815003.5614781273.0876184630.1.0002814377.5618414173.0918701931.1.0002814332.5619615613.0929751732.1.0002814332.56196996