第二章微生物的純培養和顯微技術學時安排：2學時要求：1、掌握微生物的分離和培養技術2、了解顯微鏡和顯微技術

第一節微生物的分離和純培養一、無菌技術

概述（1）培養物：微生物學中，在人為規定的條件下培養、繁殖得到的微生物群體稱為培養物。（2）純培養物和純培養的概念：微生物學中，將由一個細胞（或一種微生物）繁殖所得到的后代稱為純培養物。對微生物這種純種的培養，稱為微生物的純培養。（3）無菌技術：在分離、轉接及培養純培養物時防止其被其它微生物污染的技術稱為無菌技術。常用器具：試管、玻璃燒瓶、平皿等器皿都要滅菌培養基：培養微生物營養物質。也要滅菌常用的滅菌方法：高壓蒸汽滅菌微生物培養的常用器具及滅菌接種：在無菌條件下，用接種環把微生物從一個器皿轉接到另一個器皿，叫做接種。接種方法：燒環—冷卻—開管—沾菌和塞管—開另管—涂菌—塞另一管—火焰燒環（視頻）接種操作二、用固體培養基分離純培養菌落（CFU)的概念：由單個微生物在適宜的固體培養基表面或內部生長、繁殖到一定程度后，形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞生長群體叫菌落。菌落的大小、形狀、邊緣狀況、質地、光澤、顏色及透明度等是微生物分類、鑒定的重要依據。菌苔：固體培養基表面眾多菌落連成一片，呈片狀，這就是菌苔。平板：即培養平板，指盛有固體培養基的平皿

在自然界中，各種各樣的微生物總是混雜在一起的，要研究和利用某一微生物，就必須把它同其他微生物分開，才能得到只含有同一種微生物的純種微生物。這種方法叫純種微生物的分離純種微生物的分離涂布平板法稀釋到平板法平板劃線分離法稀釋插管法

純種微生物的分離方法涂布平板法和稀釋倒平板法

平板劃線分離法

用接種環以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續劃線，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經培養后，可在平板表面得到單菌落。三、用液體培養基分離純培養稀釋法：適用于原生動物和藻類的分離和培養四、單細胞分離顯微分離法——單細胞分離法用毛細管提取單個原生動物個體用顯微操作儀分離單個細菌五、選擇培養分離

選擇培養分離：根據微生物的營養、生理、生長條件等特點，通過選擇培養進行微生物的分離與純化技術稱為選擇培養分離。用選擇培養基進行直接分離選擇培養基：在培養基中加入某種化學物質，以抑制非需要菌的生長，促進需要菌的生長，這種培養基叫選擇培養基。高氏一號培養基加10%酚數滴，抑制其它菌的生長，分離出放線菌馬丁氏培養基加鏈霉素以抑制其它菌生長，分離出真菌。富集培養根據不同微生物間特點制定特定的環境條件，使需要的微生物生長旺盛，數量增加。加富培養基：一般指在培養基內加入額外的營養物質，使需要的微生物營養更充分，生長的更快，這種培養基叫加富培養基。土懸液—培養基+硫磺—分離出硫桿菌土懸液—以羥基苯甲酸為唯一碳源的培養基——分離出能降解羥基苯甲酸的微生物。六、二元培養物純培養物：只含有一種微生物的培養物叫做純培養物。混合培養物：含有兩種以上微生物的培養物叫做混合培養物。二元培養物:只含有二種微生物的培養物叫做二元培養物。例如寄生于細菌細胞內的病毒與細菌一起培養。七、微生物的保藏技術菌種保藏目的

給微生物一特定的條件，使其不污染、不改變特性而存活下來。菌種保藏原理

用人工方法降低微生物的代謝強度，限制微生物的生長和繁殖，使其處于休眠狀態。傳代培養保藏——隔絕空氣低溫保藏冷凍保藏——保護劑+菌種——零下196度速凍保存，或-70度冷凍室保存，-20~-30度普通冰箱冷凍室保存。干燥保藏——砂土管保存法和冷凍真空干燥保藏法紙片保藏法、薄脈保藏法、寄主保藏法等菌種保藏方法

第二節

顯微鏡和顯微技術

決定顯微觀察效果的兩個重要因素：分辨率：指能辨別兩點之間最小距離的能力反差：指樣品區別于背景的程度一、顯微鏡的種類及原理普通光學顯微鏡

光學顯微鏡的分辨率(最小分辨距)：

D=0.5λ/nsinθ

式中λ為光源波長；n為玻片到物鏡介質的折射率；θ為物鏡鏡口角的半數，它取決于物鏡的直徑和工作距離。nsniθ叫作數值孔徑。不同介質的折射率：空氣為n=1.0；水n=1.33；香柏油n=1.55。因此，油鏡的分辨率高。暗視野顯微鏡

暗視野顯微鏡利用特殊聚光器實現給樣品斜射照明，由樣品反射或折射的光再進入物鏡，這樣整個視野是暗的，只有樣品是明亮的。主要用于觀察生活細菌的運動性。暗視野和相差顯微鏡下的微生物(a)梅毒螺旋體(Treponema

pallidum),引起梅毒的螺菌；暗視野。(b)團藻屬(Volvox)和水棉屬(Spirogyra)的綠藻；暗視野。注意在成熟團藻菌落中形成的子菌落菌，及水棉屬的螺旋狀葉綠體。(c)迂回螺菌(Spirillum

volutans),具有束狀鞭毛的一種個體很大的細菌。相差。(d)肉毒梭菌(Clostridum

botulinum),引起肉毒毒素中毒的細菌，它具有近端生卵形內生孢子；相差。(e)草履蟲(Paramecium)染色后觀察到的中央大核和在其邊上的球形小核；相差。

相差顯微鏡

當光線通過標本時，由于直射光和衍射光的光程不同，就會是光波相位發生改變而產生相位差。相差顯微鏡具有環狀光闌和相差板，能將光相位差轉變為人的肉眼可以察覺的振幅差（明暗差），從而使原來的透明物體表現出明顯的明暗差異。對比度增強。因此可以在不染色的情況下，觀察到細胞的細微結構。熒光顯微鏡熒光：熒光素吸收紫外線會轉放出可見光，這就是熒光熒光顯微技術：把標本用不同的熒光素作標記，在熒光顯微鏡下，經過紫外線照射，標本會在黑暗背景下表現出有光亮的物體。使標本更便于觀察。透射電子顯微鏡

用電子波代替光源，最短波長的可見光λ=450nm；而電磁波的波長最短可以達到λ=0.005nm。所以，電鏡的分辨率遠高于光學顯微鏡。掃描電子顯微鏡（SEM）

電子槍發出電子束被磁透鏡會聚成極細的探針，在樣品表面進行掃描，電子束探針掃描到的地方可以激發樣品表面放出二次電子，二次電子的多少與樣本表面的立體形狀有關。二次電子由探測器收集并被閃爍器變成光信號，再經光電倍增管和放大器再編成電壓信號來控制熒光屏上電子束的強度。掃描隧道顯微鏡（STM）

該顯微鏡有一個半徑極細的金屬探針，將探針的針尖與樣品接近相距0.5—2nm時，進行掃描，此時再在探針和樣品之間加上零點幾伏的電壓，會有納安級的電流產生，這種電流就是隧道效應電流。通過電流變化來了解樣品表面的形貌。二、顯微觀察樣品的制備光學顯微鏡觀察樣品的制備活體觀察：

壓滴法、懸滴法、菌絲埋片法染色觀察：

一般微生物個體小而無色透明，細胞結構的折光率與背景相差很小，在光學顯微鏡下，很難看清細胞的微細結構。通過對微生物染色，借助顏色的反襯作用，提高觀察樣品不同部位的反差，從而提高對細胞微細結構的觀察效果。染色的一般步驟：涂片—干燥—固定—染色—水洗—干燥—鏡檢固定的目的:一是殺死細菌，二是使菌體粘附于玻片上，三是增加其對染料的親和力。常用的固定方法有:火焰加熱法和化學固定法。細菌的染色方法

1884年，由丹麥病理學家革蘭創造并使用的一種能鑒別細菌的染色方法。染色過程:革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌革蘭氏染色法甲菌乙菌結晶紫初染碘液媒染95%酒精脫色番紅復染紫色紅色載網：銅網、不銹鋼載網支持膜：塑料膜、碳膜、金屬膜負染色技術：用電子密度高、本身不顯示其結構，而且不與樣品反應的物質如磷鎢酸鉀對樣品染色，可以清楚的襯托出樣品表面結構。實際是讓背景著色，使背景與標本產生較大反差。投影技術：在樣品斜上方噴鍍金屬鉑或鉻，金屬面散射電子能力強，表現為暗區，無噴涂面散射電子能力弱，表現為亮區。這樣就可以了解樣品的高度和立體形狀。電子顯微鏡觀察樣品的制備透射電鏡的樣品制備超薄切片技術：標本需要制作成100納米以下的超薄切片，方能看到內部結構。基本操作過程：取樣—固定—脫水—浸透與包埋—切片—撈片—染色—觀察

取樣—脫水干燥——表面噴涂金屬導電層掃描電鏡的樣品制備第三節

顯微鏡下的微生物微生物類型：細胞型和非細胞型兩類細胞型微生物：細菌、古生菌、真核微生物非細胞型微生物：病毒、類病毒、朊病毒（見第三章）一、細菌和古生菌形態：球狀—球菌，桿狀—桿菌，螺旋狀——螺菌和弧菌。排列：單個、成對、鏈狀、成簇特殊形態的細菌如柄細菌有柄、菌絲、附器等球衣菌有衣鞘支原體無細胞壁，只有細胞膜，故柔軟形態多變有些細菌不同生長階段具有不同形態：如放線菌形成營養菌絲、氣生菌絲和孢子絲。細菌的形態也受環境條件的影響，培養時間、培養溫度等均能引起形態的改變。細菌的形態和排列球菌Staphylococcusaureus金黃色葡萄球菌Enterococcus

faecium屎腸球菌鏈球菌肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae化膿鏈球菌Streptococcuspyogenes球菌細胞形態及

其分裂面的圖解Esherichiacoli

大腸桿菌桿菌Bacillusanthracis

炭疽桿菌桿菌Pseudomonasaeruginosa

綠膿桿菌芽孢桿菌芽孢：細菌用來躲避不利環境的方式梭菌肉毒梭菌Clostridiumbotulinum破傷風梭菌Clostridiumtetani弧菌Vibrio

cholerae霍亂弧菌

螺旋體Borrelia

burgdorferi布氏疏螺旋體Treponema

pallidum蒼白密螺旋體（梅毒密螺旋體）桿狀細菌的排列方式常因生長階段和培養條件而發生變化故難作為分類依據有纖毛和鞭毛的大腸桿菌大腸桿菌纖毛大腸桿菌鞭毛有鞭毛的桿菌柄細菌

古生菌與細菌有類似的形態，它們大多都生活在生存條件十分惡劣的極端環境里。如隱蔽熱網菌是最耐熱生物之一，它的最適生長溫度為105度。古生菌的形態

古生菌的細胞形態圖解球菌大小以直徑表示；桿菌和螺旋菌以其長度和寬度表示。但是，經過干燥處理的菌體要比活菌縮短1/3——1/4；如果用襯托菌體的負染色法，器菌體可能比活菌還大。原核微生物的細胞大小

細菌大小測量微生物的表達單位為：

微米(μm=10-3mm)

納米(nm=10-6mm)

o

埃(A

=10-7mm)

微生物界研究大小范圍大致0.25~10μm(最大)0.75mm/50nm(最小)

=10~100億(細菌間)真核微生物菌物界單細胞真菌---酵母菌絲狀真菌-----霉菌大型真菌-----蕈菌粘菌假菌顯微藻類原生生物二、真菌霉菌的菌絲霉菌霉菌：絲狀真菌的總稱菌絲體：許多菌絲交織在一起，形成菌絲體菌絲種類：無隔菌絲和有隔菌絲菌絲分化：營養菌絲、氣生菌絲、繁殖菌絲霉菌的菌絲體霉菌大多酵母菌為單細胞以芽殖或裂殖進行無性繁殖酵母菌酵母菌的出芽生殖釀酒酵母的繁殖

－－出芽生殖三、藻類除藍細菌、苔蘚植物和維管束植物之外，有葉綠素，能夠進行光合作用，并伴隨釋放氧氣的一大類真核生物。藻類在供水系統長期存在可影響水質。如自來水有怪味。藻類在近海大量繁殖，可消耗大量氧氣，引起大量的海洋生物死亡，這就是赤潮。放大200倍的斜紋藻四、原生動物原生動物是一類缺少真正細胞壁，細胞通常無色，具有運動能力，并進行吞噬營養的但細胞真核生物。如草履蟲、變形蟲等。第二章重點內容1、解釋名詞無菌技術：在分離、轉接及培養純培養物時防止其被其它微生物污染的技術稱為無菌技術。純培養物和純培養的概念：微生物學中，將由一個細胞（或一種微生物）繁殖所得到的后代稱為純培養物。對微生物這種純種的培養，稱為微生物的純培養接種：在無菌條件下，用接種環把微生物從一個器皿轉接到另一個器皿，叫做接種菌落的概念：由單個微生物在適宜的固體培養基表面或內部生長、繁殖到一定程度后，形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞生長群體叫菌落。菌苔：固體培養基表面眾多菌落連成一片，呈片狀，這就是菌苔。平板：即培養平板，指盛