第三節

細胞培養的應用一、植物細胞培養與次生代謝產物制備植物細胞培養定義：

指在離體條件下，將愈傷組織等置于液體培養基中振蕩培養，得到分散游離的懸浮細胞，通過繼代培養使細胞增殖，從而獲得大量細胞群體的一種技術。（一）大規模植物細胞培養1.單細胞制備方法

（1）機械法：（2）酶解法：（3）愈傷組織誘導法：高頻振蕩使愈傷組織分散成單個細胞（二）大規模植物細胞培養1.懸浮培養

將細胞接種于液體培養基中并保持良好的分散狀態.特點:與培養液充分接觸,促進營養吸收和氣體供應;細胞增殖快,獲得高濃度細胞.（二）大規模植物細胞培養2.固定化培養

將游離細胞包埋在支持物內部或表面進行培養的一種方法.特點:維持細胞良好的穩定性。方法：

吸附固定法、離子/共價交聯法、共價結合法、包埋法、微囊化等。3.大規模植物細胞的生物反應器（1-1）機械攪拌式反應器優點：混合性能好傳氧效率高操作彈性大可用于細胞高密度培養；缺點：剪切力大。（1-1）機械攪拌式反應器攪拌式反應器結構示意圖1—攪拌器；2—罐體；3—夾套；4—攪拌軸；5—壓出管；6—支座；7—人孔；8—軸封；9—傳動裝置

典型的攪拌結構（1-2）非機械攪拌式反應器

非攪拌式反應器所產生的剪切力較小，結構簡單。其主要類型有鼓泡式反應器、氣升式反應器等氣體攪拌式反應器氣升式反應器鼓泡式反應器1—分布格板；2—夾套；3—氣體分布器；4—塔體；5—擋板；6—塔外換熱器；7—液體捕集器；8—擴大段（1-3）組合式反應器利用“優勢互補”原則，將兩種反應器結合起來研究出組合式反應器。帶有低速攪拌的氣升式發酵罐可彌補低氣速時混合性差的弱點。（1-4）光生物反應器（1-5）轉鼓式生物反應器（2-1）固定化培養的生物反應器——流化床兩類:液-固兩相氣-液-固三相優點：細胞與流體能充分混合、接觸。不足：細胞與流體碰撞易傷細胞（2-2）固定化培養生物反應器——固定化床固定床生物反應器兩類:填充床反應器涓流床反應器（三）植物細胞培養制備代謝產物

細胞代謝產物包括初級代謝產物與次級代謝產物.1.初級代謝產物：

通過初級代謝產生的維持細胞生命活動必需的物質。如：AA、核苷酸、多糖、維生素等。2.次級代謝產物：

通過次級代謝合成的分子結構較復雜的小分子化合物。如：抗生素、生物堿、毒素等。（三）植物細胞培養制備代謝產物次級代謝產物的利用：

（1）藥用：如紫杉醇、生物堿類、萜類等（2）食品、食品添加劑：如胡蘿卜素、甜菊苷、辣椒素等。（3）殺蟲劑、殺菌劑：如萬壽菊細胞培養產物農藥噻吩烷、葫蘆巴培養產物藍魚藤酮等。（4）飼料、精細化工產品：（四）生產次生代謝產物的細胞株要求分散好,適合于大規模懸浮培養;均一性好,大小與生理狀況一致;生長快;目標產物含量高;細胞遺傳性能穩定.二、動物細胞培養與表達制備藥用蛋白

1962年開始，用于生物醫學研究，生產酶制劑，生長因子，疫苗，單抗等。如：纖溶酶原激活劑（t-PA）、神經生長因子（NGF）、乙肝疫苗（HbsAg）、干擾素（IFN）、白介素（IL）等（一）病毒疫苗生產：Vero細胞培養DMEM培養基胎牛血清其他成分錐形瓶逐級放大培養加堿（碳酸氫鈉）加糖（葡萄糖）灌注培養液微載體5L種子罐培養培養液50L生物反應器接種狂犬病毒出液口收獲病毒（二）基因工程藥物生產——重組干擾素（IFN）定義：

由病毒或誘生劑刺激機體細胞產生的具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節作用的糖蛋白。

種類：

IFN-α——白細胞產生；IFN-β——成纖維細胞產生；IFN-γ——致敏T細胞產生干擾素作用機制干擾素的生產：傳統方法：從人血液中的白細胞內提取每300L血液才能提取1mg

基因工程：將干擾素基因轉移到大腸桿菌中。每千克培養液可提取20-40mg。我國的基因工程重組IFN有:

α1b(如賽若金:科興\軍事預防科學院等)α2b(如安達芬:長春生物等)細胞IFN誘生劑產生特異性因子，使阻抑蛋白滅活干擾素基因解除抑制IFN基因活化產生干擾素體內干擾素產生機制:重組干擾素生產機制干擾素生產車間實例：（1）過程1表示可以通過人工合成方法獲得干擾素基因。其主要步驟可概括為：由干擾素中_______順序推導出__________順序，再進一步推導出_______順序。人工合成的干擾素基因在實驗室可通過_____技術進行人工擴增。氨基酸mRNA的堿基基因的堿基PCR實例：（2）過程2需要的工具酶有__________________。（3）欲將大腸桿菌b篩選出來，應利用基因表達載體（重組DNA分子）上的_____。（4）干擾素不能在高溫環境中保存，其原因是_____________________________。限制性內切酶和DNA連接酶標記基因干擾素是蛋白質，高溫下會變性（三）單克隆抗體生產1.何謂單克隆抗體？

通過B細胞雜交瘤技術,獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細胞克隆，產生均一性的抗體.

單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞(myelomacell)與經特定抗源免疫刺激的B淋巴細胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細胞(hybridomacell)，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術又稱為雜交瘤技術(hybridomatechnology）。2.雜交瘤技術的基本原理2.雜交瘤技術的基本原理實例：下圖為某同學根據雜交瘤技術的方法，設計的生產破傷風桿菌抗體的實驗方案。請據圖回答：

（1）該方案能達到預期效果嗎？

。原因是沒有將抗原注入小鼠體內，無法獲得產生單一抗體的效應B細胞

不能（2）圖中②為

過程，常用

作為誘導劑。該細胞繼承了

，因此不僅能

，還有

本領。（3）圖中③進行細胞培養，目的是

。

細胞融合和篩選滅活的病毒雙親細胞的遺傳物質大量繁殖產生特異性抗體在體外條件下大量增殖（4）在制備破傷風桿菌抗體的過程中，進行了兩次篩選，其目的不同，②是通過篩選獲得

，④是通過篩選獲得

。（5）圖中⑤的培養能獲得

細胞，便于大規模培養。雜交瘤細胞能產生特定