第五章酶的分子修飾和改造第一節酶化學修飾的原理和方法一、酶的化學修飾原因1．穩定性不夠，不能適應大量生產條件的需要。2．作用的最適條件不符。3．酶的主要動力學性質的不適應。4．臨床應用的特殊要求。

酶化學修飾的應用理論研究酶中特定基團之間的距離氨基酸殘基的存在狀態氨基酸測序確定酶活性部位氨基酸數量測定醫藥解除醫用酶免疫源性和抗原性

提高醫用酶穩定性延長醫用酶體內半衰期生物技術領域改變酶最適pH

改變酶底物專一性有機溶劑可溶解酶提高酶耐熱、酸、堿、有機溶劑能力二、酶修飾的方向1．核酸水平：利用基因操作技術對DNA或mRNA進行改造或修飾2．蛋白質水平：人們用化學法或酶法對酶的一級結構進行改造氨基酸的置換肽鏈有限切除氨基酸殘基的修飾等三、酶化學修飾的基本原理1．增強酶天然構象的穩定性與耐熱性酶與修飾劑交聯后，使酶的天然構象產生“剛性”，不易伸展打開，從而增強酶的熱穩定性。2．保護酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶共價交聯后，其產生的空間障礙或靜電斥力能有效地阻擋抑制劑對酶的進攻，同時“遮蓋”保護酶活性部位，使抑制劑和酶結合的難度增加，使酶的抗抑制劑能力增強。

三、酶化學修飾的基本原理3．維持酶功能結構的完整性與抗蛋白水解酶大分子修飾劑產生的空間障礙可阻擋蛋白水解酶接近酶分子，能“遮蓋”酶分子上敏感鍵免遭破壞。酶分子上許多敏感基團參與修飾反應，也減少了酶分子遭受蛋白水解酶攻擊破壞的可能性。

4.消除酶的抗原性有些組成抗原決定簇的基團與修飾劑形成共價鍵，破壞了酶分子上抗原決定簇的結構，使酶抗原性降低乃至消除。能“遮蓋“抗原決定簇和阻礙抗原、抗體產生結合反應。四、對修飾劑的了解1．修飾劑的分子量、修飾劑鏈的長度、對蛋白質的吸附性2．修飾劑上反應基團的數目及位置3．修飾劑上反應基團的活化方法與條件五、酶性質的了解1．酶活性部位情況2．酶的穩定條件、酶反應最適條件3．酶分子側鏈基團的化學性質及反應活潑性等六、反應條件的選擇1．反應體系中酶與修飾劑的分子比例2．反應體系的溶劑性質，鹽濃度和pH條件3．反應溫度及時間七、酶修飾方法1．酶分子側鏈基團的化學修飾2．有機大分子對酶的化學修飾3．蛋白質類及其他第二節酶分子側鏈基團的化學修飾一、幾種重要的修飾反應1.酰化及其相關反應修飾劑：乙酰咪唑、二異丙基氟磷酸、丹磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯、O-甲基異脲等。修飾殘基：氨基、羥基、酚基、巰基等。2．烷基化反應修飾劑：2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、碘甲烷、苯甲酰鹵代物等。修飾殘基：氨基、巰基、羧基、甲硫基、咪唑基等。3．氧化和還原反應修飾劑：氧化試劑（H2O2、N-溴代琥珀酰亞胺等）；還原劑（2-巰基乙醇、巰基乙酸和二硫蘇糖醇等）修飾殘基：巰基、甲硫基、吲哚基、酚基等（氧化）；二硫鍵（還原）。4．芳香環取代反應修飾劑：四硝基甲烷修飾殘基：Tyr，Phe。二、特定氨基酸殘基側鏈基團的化學修飾1．巰基的化學修飾巰基是許多酶活性中心的催化基團形成二硫鍵穩定酶的結構最容易反應的側鍵基團之一通過修飾可提高酶的穩定性烷基化試劑是一種重要的巰基修飾試劑，特別是碘乙酸和碘乙酰胺；常用N-乙基馬來酰亞胺、5,5′-二硫-2-硝基苯甲酸（ＤＴＮＢ）。DTNB（Ellman試劑）用于定量酶分子中巰基數目。2．氨基的化學修飾Lys的氨基是酶分子中活性很高的基團，容易被修飾。常用氨基修飾試劑：乙酸酐、２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）、碘代乙酸、還原烷基、。２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）可用于測定酶蛋白中Lys數量。常用２，４-二硝基氟苯(DNFB，Sanger試劑)、丹磺酰氯(DNS)修飾多肽鏈N末端，用于N末端的測定。3.羧基的化學修飾主要涉及谷氨酸和天冬氨酸。產物一般為含酯類或酰胺類的修飾酶。水溶性的碳二亞胺為最常用的修飾劑，可定量測定羧基含量。．咪唑基的化學修飾：焦碳酸二乙酯。．胍基的化學修飾：丁二酮和1，2-環己二酮為修飾劑。．二硫基的化學修飾：通常通過還原的方法進行修飾。7.分子內交聯修飾采用含有雙功能基團的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等，與酶蛋白分子中兩個側鏈基團反應，形成共價交聯，可以使酶分子的空間構象更為穩定，從而提高酶的穩定性的修飾方法稱為分子內交聯修飾。三、小分子修飾劑的作用1.用于酶分子結構和功能的研究2.用于改進酶性質

第三節有機大分子對酶的修飾一、概念利用水溶性大分子與酶結合，使酶的空間結構發生某些精細的改變，從而改變酶的特性二、常使用的水溶性大分子修飾劑糖及糖的衍生物（右旋糖酐、糖肽、SephadexG-25）聚乙二醇、大分子多聚物（如乙烯酮、乙烯乙酸、丙烯酸等的單聚或共聚物）具有生物活性的大分子物質（如肝素）、蛋白質等。修飾的方法如：溴化氰法、高碘酸氮化法、戊二醛法、疊氮法、琥珀酸法和三氯均嗪法等三、舉例3.1聚乙二醇及其修飾反應聚乙二醇的特點：①線性分子HO-CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2-OH；②具有良好的生物相容性和水溶性；③在體內無毒性、無殘留、無免疫原性；④末端活化后可與酶產生交聯；⑤覆蓋在酶分子表面形成疏松的親水外殼，導致流體動力學發生改變。（一）疊氮法將PEG的末端羥基轉化為疊氮基，然后與酶反應。⑴PEG甲氧甲酰甲酯制備⑵PEG酰肼制備⑶PEG羧甲基疊氮化物制備⑷活化PEG與酶交聯

（二）琥珀酸酐法用二溴代琥珀酸酐在溫和堿性條件下將PEG活化，經減壓濃縮得活化PEG，可與酶分子上氨基交聯。（三）三氯均嗪法PEG經三氯均嗪法活化后，用石油醚抽提或減壓蒸餾，制得活化PEG。（四）羰二亞胺法修飾酶分子上的羧基。3.2糖類的修飾反應（一）右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯的修飾反應1.溴化氰法右旋糖苷經溴化氰活化后，在堿性條件下與酶的游離氨基共價連接，生成修飾酶。2.高碘酸氧化法高碘酸將右旋糖苷上鄰雙羥基氧化成醛基，醛基再與酶分子上的氨基結合而生成修飾酶。（二）糖肽的修飾反應糖肽分子上有游離氨基，活化后能與酶分子上氨基反應。①2,3-異氰酸甲苯活化法②戊二醛法3.3合成大分子多聚物修飾酶（一）聚N-乙烯吡咯烷酮N-乙烯吡咯烷酮修飾酶時，首先要開環水解，經活化反應，才能與酶聯結。（二）聚乙烯醇修飾酶聚乙烯醇與硝基苯酰氯反應后，其產物的硝基用連二亞硫酸鈉還原成氨基，與酶分子中羧基共價連接。（三）聚氨基酸修飾酶聚賴氨酸修飾酶Lys上的氨基與含羧基較多的酶的羧基通過羰二亞胺產生交聯。3.4天然大分子對酶的修飾作用肝素修飾酶肝素由氨基葡萄糖和兩種糖醛酸組成。羰二亞胺法用羰二亞胺活化肝素分子上的羧基后，與酶上的氨基共價連接。人血清白蛋白修飾酶戊二醛法利用戊二醛雙功能使白蛋白上的和酶分子上的氨基相互交聯。第四節其它修飾方法及修飾酶的性質一、金屬離子置換修飾1．概念：通過改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發生改變的方法稱為金屬離子置換修飾。2．常用離子常用二價金屬離子。3．修飾方法二、肽鏈有限水解修飾用專一性較強的蛋白酶或肽鏈為修飾劑，使肽鏈部分水解，使酶的空間結構發生某些精細的改變，從而改變酶的性質和功能。增加某些酶的活性減少或消除某些酶的抗原性。三氨基酸置換修飾將肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸，引起酶蛋白空間構象的某些改變，從而改變酶的性質和功能。提高酶活力或增加酶穩定性。例：對β-干擾素修飾，將17位半胱氨酸→組氨酸，提高穩定性

mRNAUGU,UGC→AUG,AGCDNAACA,ACG→TCA,TCG

將A突變成T，定點突變修飾酶的性質1、修飾酶的熱穩定性2、修飾酶的抗原性3、修飾酶對各類失活因子的抵抗力4、修飾酶在體內的半衰期5、最適pH6、Km的變化第五節酶的生物改造一．理論來源二．概念三．定向進化的選擇策略四．定向進化的應用一．理論來源利用基因工程原理可以在實驗室中模擬生物進化過程化學進化生物進化二．概念隨機突變+定向選擇＝目標突變體細菌誘發突變的因素50

0C培養突變體庫選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長溫度為370C最適生長溫度提高了！定向進化屬于蛋白質的非合理設計，不需事先了解酶的空間結構和催化機制，人為地創造特殊的進化條件，模擬自然進化機制（隨機突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（或篩選）出所需性質的突變酶。定向進化不是定點突變定向進化：突變篩選

突變位點是隨機的，不確定的；突變位點的數目也是不確定的；突變的效應更是不可預知的；理論上講，凡是能夠引起突變的因素（物理的，化學的，生物的）都可以應用于定向進化中突變體的產生。定點突變：

突變位點是確定的，突變的個數也是預知的；突變的效應可能是已知的，也可能是未知的；定點突變的方法一般是以PCR技術為基礎的。三．定向進化的選擇策略突變蛋白酶選擇平板初選，配合活性染色和X光片消化分析定向進化的基本方法高突變菌株Stratagene

公司構建了缺失DNA修復3個途徑的大腸桿菌菌株，基因突變率高5000倍易錯PCRDNAshuffling體外定向進化四定向進化的應用1．提高酶分子的催化活力L—天冬氨酸酶定向進化研究進行4輪易錯PCR，篩選了3000個菌落。得到酶活力提高28倍的突變體，該酶的pH穩定性和熱穩定性均優于天然酶2．提高酶分子的穩定性T4溶菌酶11個不同的單點突變株將Tm提高0.8-1.4℃.8株大腸桿菌核酸酶HI單點突變中，7株Tm提高了0.7-4.2℃3．提高底物的專一性和增加對新底物的催化活力Beuve和Danchin展示腺苷酸環化酶突變后，鳥苷酸環化酶活力提高了4.5倍，但腺苷酸環化酶