第二章

核酸化學TheChemistryofNucleicAcid衛生技工學校王巧玲核酸(nucleicacid)

是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。一、核酸的發現和研究工作進展1868年FridrichMiescher（弗雷德里希、米歇爾）從膿細胞中提取“核素”

1944年

Avery（埃弗里）等人證實DNA是遺傳物質1953年Watson和Crick發現DNA的雙螺旋結構1968年Nirenberg發現遺傳密碼1975年Temin和Baltimore發現逆轉錄酶1981年Gilbert和Sanger建立DNA測序方法1985年Mullis發明PCR技術1990年美國啟動人類基因組計劃(HGP)

1994年中國人類基因組計劃啟動2001年美、英等國完成人類基因組計劃基本框架FriedrichMiescher(1844-1895)FriedrichMiescherworkedatthePhysiologicalLaboratoryoftheUniversityofBaselandinTübingenandismostwellknownforhisdiscoveryofthenucleicacids.(DNAPioneersandTheirLegacybyUlfLagerkvist,1998,YaleUniversityPress,ISBN0-300-07184-1).Toreadexcerptsfromthisbook,clickDNAPioneers

.米歇爾FriedrichMiescher（1844－1895）米歇爾，瑞士生物學家，生前工作于巴塞爾大學的生理學研究室。以發現核酸而聞名世界。米歇爾小時候有嚴重的聽力障礙，因此在童年時代，盡管他非常聰明，但總是害羞并很內向。他酷愛音樂，與其父親一樣是一個天才歌手，在學校的學習成績很好。1865年米歇爾成為一名醫學生，1868年獲醫學博士學位。但聽力問題是他成為臨床醫生的障礙。1868年，米歇爾感興趣研究白細胞。為了得到足夠的白細胞，他從醫院的外科繃帶中洗脫膿液的白細胞，分離細胞核，得到一些粘稠的物質，并經實驗證明含有磷和氮，稱為核素。隨后的研究證明這一物質具有酸性，故稱為核酸。這是米歇爾首次發現了重要的生命物質之一—核酸。

1879年Kossel(科塞爾)經過10年的努力,搞清楚核素中有四種不同的組成部分:A,T,C和G。1889年Altman（阿特曼）建議將核素改名為“核酸”,并且已經認識到“核素”乃“核酸”與蛋白質的復合體。

1909年Levene（萊文）發現酵母的核酸含有核糖。

1930年Levene發現動物細胞的核酸含有一種特殊的核糖即脫氧核糖,得出了一個錯誤概念:植物核酸含核糖,動物核酸含脫氧核糖。這個錯誤概念一直延續到1938年，這時方清楚RNA和DNA的區別。Levene還提出了核酸的“磷酸-核糖(堿基)-磷酸”的骨架結構,解決了DNA分子的線性問題,還在1935年提出“四核苷酸”學說,認為這四種核苷酸的聚合體是構成核酸的基本單位。Reichard,P.J.Biol.Chem.2002;277:13355-13362OswaldT.

Avery(1877-1955).埃弗里，O.T.OswaldTheodoreAvery

(1877～1955)美國細菌學家。1877年10月21日生于加拿大新斯科舍哈利法克斯。1904年畢業于哥倫比亞大學醫學院，后到布魯克林的霍格蘭實驗室研究并講授細菌學和免疫學。1913年轉到紐約的洛克菲勒研究所附屬醫院工作，直到1948年退休。他和C.麥克勞德、M.麥卡錫于1944年重做1928年Griffith（格里菲斯）的細菌轉化實驗共同發現不同型的肺炎雙球菌的轉化因子是DNA。這項實驗第一次證明了遺傳物質是DNA而不是蛋白質。雖然這一發現，曾引起爭論和懷疑，但的確推動了DNA的研究，直至1953年DNA雙螺旋結構的發現。他還通過對肺炎雙球菌的免疫性研究，提出肺炎雙球菌可根據其免疫的專一性來進行分類，而這種免疫專一性是由于不同菌型的莢膜中所含的多糖引起的。由此他建立起對不同型肺炎雙球菌的靈敏檢驗法。1955年2月20日卒于美國田納西州納什維爾。1928年Griffith的細菌轉化實驗

1944年Avery等重做1928年Griffith（格里菲斯）的細菌轉化實驗，證明DNA是遺傳物質。但人們對此持懷疑態度，理由是：（1）因認為蛋白質相對分子質量大，結構復雜，二十種氨基酸的排列組合將是個天文數字，可作為一種遺傳信息。而DNA相對分子質量小，只含4種不同的堿基，人們一度認為不同種的有機體的核酸只有微小的差異。（2）認為轉化實驗中DNA并未能提得很純，還附有其它物質。（3）即使轉化因子確實是DNA，但也可能DNA只是對莢膜形成起著直接的化學效應，而不是充當遺傳信息的載體。

1952年Hershey&Chase（赫希和蔡斯）的T2噬菌體感染實驗進一步證明DNA是遺傳物質。1952年HersheyandChase的T2噬菌體感染實驗二、核酸的分類及分布90%以上分布于細胞核，其余分布于核外如線粒體，葉綠體，質粒等。分布于細胞質中。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脫氧核糖核酸核糖核酸攜帶遺傳信息，決定細胞和個體的基因型(genotype)。參與細胞內DNA遺傳信息的表達。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。核酸第一節核酸分子的化學組成TheChemicalComponentofNucleicAcid1.元素組成C、H、O、N、P（9~10%）2.分子組成一、核酸的化學組成戊糖（構成RNA）1′2′3′4′5′核糖(ribose)（構成DNA）脫氧核糖(deoxyribose)β-D-核糖β-D-2-脫氧核糖嘌呤(purine)腺嘌呤(adenine,A)鳥嘌呤(guanine,G)堿基嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)（構成RNA）（構成DNA）核苷：AR,GR,UR,CR脫氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR1.核苷(ribonucleoside)的形成堿基和核糖（脫氧核糖）通過糖苷鍵連接形成核苷（脫氧核苷）。1′1二、核酸的基本組成單位——核苷酸核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脫氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP

2.核苷酸(ribonucleotide)核苷（脫氧核苷）和磷酸以磷酸酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）。

12345核酸戊糖堿基核苷核苷酸RNAβ－D－核糖A（腺嘌呤）G（鳥嘌呤）C（胞嘧啶）U（尿嘧啶）AR(腺苷）GR(鳥苷）CR(胞苷）UR(尿苷）AMPGMPCMPUMPDNAβ－D－2－脫氧核糖A（腺嘌呤）G（鳥嘌呤）C（胞嘧啶）T（胸腺嘧啶）dAR(脫氧腺苷）dGR(脫氧鳥苷）dCR(脫氧胞苷）dTR(脫氧胸苷）dAMPdGMPdCMPdTMPDNA 與RNA基本組成成分比較3.體內重要的游離核苷酸及其衍生物含核苷酸的生物活性物質：NAD+（輔酶Ⅰ）、NADP+（輔酶Ⅱ）、CoA-SH、FAD

等都含有AMP

多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP環化核苷酸:cAMP，cGMPAMPADPATPcAMPNADP+NAD+第二節核酸的一級結構5′端3′端核苷酸的連接一分子的核苷酸的3’-羥基團與另一分子核苷酸的5’-磷酸基團通過脫水可形成3’,5’-磷酸二酯鍵，從而將兩分子核苷酸連接起來。

CGA定義指多核苷酸鏈中核苷酸的種類、比例和排列順序。由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列。5′端3′端CGA核酸的一級結構編寫式：DNA:5’-A-T-G-C-A-3’RNA:5’-U-G-C-C-A-3’第三節DNA的空間結構——雙螺旋結構、三級結構1.DNA雙螺旋結構的研究背景堿基組成分析Chargaff規則：[A]=

[T][G]

[C]堿基的理化數據分析（滴定）A-T、G-C以氫鍵配對較合理DNA纖維的X-線衍射圖譜分析沃森和克里克在實驗室成功搭建DNA分子雙螺旋結構模型。2、DNA雙螺旋結構模型要點（1）DNA分子由兩條脫氧多核苷酸鏈(簡稱DNA單鏈)組成，兩條鏈沿著同一根軸平行盤繞，形成右手雙螺旋結構。螺旋中的兩條鏈方向相反，即其中一條鏈的方向為5′→3′，而另一條鏈的方向為3′→5′。（2）磷酸基和脫氧核糖位于螺旋外側，彼此之間通過磷酸二酯鍵連接，形成DNA骨架。嘌呤堿和嘧啶堿基位于螺旋的內側，糖環平面與堿基環平面之間的角度近似直角。（3）雙螺旋的直徑約為2nm。每條鏈相鄰兩個堿基平面之間的距離為0.34nm，兩個核苷酸之間的夾角為36°。每10個堿基對形成一個螺旋，其螺矩（即螺旋旋轉一圈）高度為3.4nm。2.0nm小溝大溝（4）兩條鏈由堿基間氫鍵相連。堿基間形成氫鍵有一定的規律：腺嘌呤與胸腺嘧啶成對，鳥嘌呤與胞嘧啶成對。A和T間形成兩個氫鍵，G和C間形成三個氫鍵，這種堿基之間相互配對稱為堿基互補。（5）沿螺旋軸方向觀察，配對的堿基并不充滿雙螺旋的全部空間。由于堿基對的方向性，使得堿基對占據的空間不對稱，因此在雙螺旋的表面形成兩個凹下的槽，一個較大，一個較小，分別稱為大溝和小溝，又可稱為深溝和淺溝。(6)DNA雙螺旋的穩定因素DNA雙螺旋結構在生理條件下是很穩定的。雙螺旋穩定的力：氫鍵堿基堆積力（疏水相互作用及范德華力）離子鍵等則DNA變性劑（熱、pH、脲/酰胺、有機溶劑）DNA右雙螺旋結構模型要點總結（Watson,Crick,1953）1、右雙螺旋，反向平行2、堿基在內，主鏈在外3、堿基互補，A＝T，G≡C4、螺旋一圈，十對堿基5、結構穩定，副鍵維系6、大溝小溝，調節關鍵3、DNA的三級結構在DNA雙螺旋二級結構的基礎上，雙螺旋扭曲或再次螺旋就構成DNA的三級結構。超螺旋是DNA三級結構的一種常見形式。超螺旋的形成與分子能量狀態有關。（1）原核生物DNA的三級結構

絕大多數原核生物的DNA都是共價封閉的環狀雙螺旋。如果再進一步盤繞則形成麻花狀的超螺旋三級結構。（2）真核生物中的核小體結構在真核生物中，雙螺旋的DNA分子圍繞一蛋白質八聚體進行盤繞，從而形成特殊的串珠狀結構，稱為核小體。核小體是染色質的基本組成單位。4、DNA的功能（1）生物遺傳信息的載體（2）基因復制和轉錄的模板基因：具有遺傳效應的DNA片段，是遺傳信息的結構和功能單位。分類：（1）編碼蛋白質（2）沒有翻譯產物（3）不轉錄的DNA片段基因診斷：利用現代分子生物學和分子遺傳學的技術和方法，直接檢測基因結構或表達水平是否正常，從而對疾病做出診斷的方法?；蛑委煟褐笇⑷说恼；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷并發揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫學新技術。基因組：指一個細胞或生物體所含的全套基因?；蚪M學：就是發展和應用DNA制圖、測序新技術以及計算機程序，分析生命體全部基因結構和功能的一門學科。原核生物基因組特點：1.基因組較小，通常只有一個DNA分子2.功能相關的基因常構成一個轉錄單位——操縱子（Operon）3.無重復序列4.DNA順序所含有的結構基因是連續的，一般不含有間隔序列或很短5.有重疊基因1.基因組較大2.不存在操縱子結構3.有重復序列（1）高度重復序列（衛星DNA）（2）中度重復序列A.串聯重復序列：小衛星DNA,微衛星DNA和rDNAB.散布重復序列:短散布元件，長散布元件和轉座子（3）低度重復序列（4）單一序列4.有斷裂基因（內含子和外顯子）真核生物基因組特點：雞卵清蛋白的基因第四節RNA的空間結構（一）RNA的類型mRNAtRNArRNA少數RNA病毒（二）RNA的結構特征（1）RNA的基本組成單位是AMP、GMP、CMP和UMP。一般含有較多種類的稀有堿基核苷酸。（2）每分子RNA中約含有幾十個至數千個NMP,與DNA相似，彼此通過3’,5’-磷酸二酯鍵連接而成多核苷酸鏈。（3）RNA主要是單鏈結構，但局部區域也卷曲形成雙螺旋結構，或稱為發夾結構(hairpairstucture)。雙鏈部位的堿基一般彼此形成氫鍵而互相配對，即A-U及G-C，雙鏈區有些不參與配對的堿基往往被排斥在雙鏈外，形成環狀突起。(4)RNA與DNA對堿的穩定性不同，RNA易被堿水解，使5’-磷酸酯鍵斷開，形成3’-磷酸酯鍵的單核苷酸。（三）參與蛋白質生物合成的三類RNA的結構1.轉運RNA(tRNA)的結構與功能（1）一級結構tRNA分子量最小，由74-95個核苷酸組成；含有較多的稀有堿基；3’末端為-C-C-A-OH結構。（2）tRNA的二級結構tRNA的二級結構由于局部雙螺旋的形成，含有3個發夾結構、4個螺旋區、3個環和1個附加叉而呈現“三葉草”形，故稱為“三葉草”結構。

tRNA的“三葉草”形結構包括：氨基酸臂、DHU（二氫尿嘧啶）環、反密碼環、額外環和Tψ(胸苷假尿苷)環五部分。氨基酸臂TψC環反密碼環DHU環額外環(1)氨基酸接受區

包含有tRNA的3’-末端和5’-末端，3’-末端的最后3個核苷酸殘基都是CCA，A為核苷。氨基酸可與其成酯，該區在蛋白質合成中起攜帶氨基酸的作用。

(2)反密碼區

與氨基酸接受區相對的一般含有7個核苷酸殘基的區域，其中正中的3個核苷酸殘基稱為反密碼子。

（3)二氫尿嘧啶區該區含有二氫尿嘧啶。(4)TC區該區與二氫尿嘧啶區相對，假尿嘧啶核苷—胸腺嘧啶核糖核苷環(TC)由7個核苷酸組成，通過由5對堿基組成的雙螺旋區(TC臂)與tRNA的其余部分相連。除個別例外，幾乎所有tBNA在此環中都含有TC。(5)可變區位于反密碼區與TC區之間，不同的tRNA該區變化較大。*tRNA的三級結構——倒L形*tRNA的功能活化、搬運氨基酸到核糖體，參與蛋白質的翻譯。2.信使RNA的結構與功能hnRNA內含子(intron)mRNA*mRNA成熟過程

外顯子(exon)目錄*mRNA結構特點1.大多數真核mRNA的5′末端均在轉錄后加上一個7-甲基鳥嘌呤-三磷酸核苷，同時第一個核苷酸的C′2也是甲基化，形成帽子結構：m7GpppN。2.大多數真核mRNA的3′末端有一個多聚腺苷酸(polyA)結構，稱為多聚A尾。帽子結構帽子結構可保護mRNA免受核酸酶從5’端的降解作用，并在翻譯起始中具有促進核糖體與mRNA的結合、加速翻譯起始速度的作用。多聚A尾可增加mRNA的穩定性和維持其翻譯活性。帽子結構和多聚A尾的功能*mRNA的功能把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補配對原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質的氨基酸排列順序。DNAmRNA蛋白轉錄翻譯原核細胞細胞質細胞核DNA內含子外顯子轉錄轉錄后剪接轉運mRNAhnRNA翻譯蛋白真核細胞原核生物mRNA結構特點一般都為多順反子結構。即一個單鏈mRNA分子可作為多種多肽和蛋白肽鏈合成的模板。mRNA的轉錄和翻譯是耦合的，即mRNA分子一邊進行轉錄，同時一邊進行翻譯。mRNA分子包含有先導區、翻譯區和非翻譯區，即在兩個順反子之間有不參加翻譯的插入序列。真核生物mRNA結構特點mRNA的3’-末端有一段多聚腺苷酸（polyA),5’-末端有帽子結構。mRNA一般為單順反子，即一個mRNA分子只為一種多肽編碼。mRNA的轉錄和翻譯是分開進行的，先在核內轉錄產生hnRNA,轉運到胞質內后，再在核外加工為成熟的mRNA，然后起翻譯作用。*rRNA的結構3.核糖體RNA的結構與功能*rRNA的功能參與組成核蛋白體，作為蛋白質生物合成的場所。16SrRNA*rRNA的種類（根據沉降系數S）真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNA核蛋白體的組成原核生物（以大腸桿菌為例）真核生物（以小鼠肝為例）小亞基30S40SrRNA16S1542個核苷酸18S1874個核苷酸蛋白質21種占總重量的40%33種占總重量的50%大亞基50S60SrRNA23S5S2940個核苷酸120個核苷酸28S5.85S5S4718個核苷酸160個核苷酸120個核苷酸蛋白質31種占總重量的30%49種占總重量的35%1、一般理化性質兩性物質，通常表現為酸性DNA純品為白色纖維狀固體，RNA純品為白色粉末，均微溶于水，不溶于有機溶劑DNA溶液的粘度極高，而RNA溶液要小得多溶液中的核酸分子在引力場的作用下可以沉降。第五節核酸的主要理化性質2、核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據。以A260/A280進行定性、定量。DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外下發出熒光。增色效應：核酸水解為核苷酸，A260增高30%~40%的現象。3、核酸的變性(denaturation)定義：雙螺旋區氫鍵斷裂，空間結構破壞，形成單鏈無規線團狀態的過程。方法：強酸，強堿，高溫，變性試劑如尿素、酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等。變性后其它理化性質變化：A260增高（增色效應）粘度下降比旋度下降

浮力密度升高生物活性喪失DNA變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂例：變性引起紫外吸收值的改變DNA的紫外吸收光譜增色效應：DNA變性時其溶液A260增高的現象。熱變性解鏈曲線：如果在連續加熱DNA的過程中以溫度對A260（absorbance260，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線或熱變性曲線。Tm：變性是在一個相