人I型膠原蛋白（Col-1）酶聯免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用。檢測范圍：96T1.5yg/L-40yg/L使用目的：本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關液體樣本中I型膠原蛋白（Col-I）含量。實驗原理本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人I型膠原蛋白（Col-I）水平。用純化的人I型膠原蛋白（Col-I）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入I型膠原蛋白（Col-I），再與HRP標記的I型膠原蛋白（Col-I）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的I型膠原蛋白（Col-I）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人I型膠原蛋白（Col-I）濃度。試劑盒組成130倍濃縮洗滌液20mlX1瓶7終止液6mlX1瓶2酶標試劑6mlX1瓶8標準品（80yg/L）0.5mlX1瓶3酶標包被板12孔X8條9標準品稀釋液1.5mlX1瓶4樣品稀釋液6mlX1瓶10說明書1份5顯色劑A液6mlX1瓶11封板膜2張6顯色劑B液6mlX1/瓶12密封袋1個標本要求1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20°C保存，但應避免反復凍融不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。40gg/L5號標準品150山的原倍標準品加入150gl標準品稀釋液20gg/L4號標準品150山的5號標準品加入150gl標準品稀釋液10gg/L3號標準品150山的4號標準品加入150gl標準品稀釋液5gg/L2號標準品150山的3號標準品加入150gl標準品稀釋液2.5yg/L1號標準品150山的2號標準品加入150gl標準品稀釋液2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50卩1,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40卩1,然后再加待測樣品10卩1（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。溫育：用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘。配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用洗滌：小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。加酶：每孔加入酶標試劑50卩1，空白孔除外。溫育：操作同3。洗滌：操作同5。顯色：每孔先加入顯色劑A50yl，再加入顯色劑B50yl，輕輕震蕩混勻，37C避光顯色15分鐘.終止：每孔加終止液50卩1，終止反應（此時藍色立轉黃色）。測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。操作程序總結：計算以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。注意事項1．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數伍倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數（XnX5）o封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。底物請避光保存。嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標