工業(yè)微生物的菌種選育與保藏第一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)菌種的分離簡(jiǎn)介

一、菌種的來(lái)源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門(mén)索取或購(gòu)買(mǎi)；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。第二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日二、分離思路

新菌種的分離是要從混雜的各類(lèi)微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來(lái)。實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進(jìn)行分離純化。有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。第三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長(zhǎng)培養(yǎng)特性。采樣：有針對(duì)性地采集樣品。增殖：人為地通過(guò)控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)。分離：利用分離技術(shù)得到純種。發(fā)酵性能測(cè)定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營(yíng)養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長(zhǎng)和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟第四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

（一）采樣1、采樣對(duì)象以采集土壤為主。田園土和耕作過(guò)的沼澤土中，以細(xì)菌和放線(xiàn)菌為主。富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對(duì)象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。第五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日從自然界篩選第六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類(lèi)型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分離。第七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日（二）增殖培養(yǎng)

為了容易分離到所需的菌種，讓無(wú)關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過(guò)配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來(lái)控制。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長(zhǎng)，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對(duì)下階段的純種分離就會(huì)順利得多。第八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日（三）培養(yǎng)分離

盡管通過(guò)增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長(zhǎng)狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這—步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。純種分離的方法有劃線(xiàn)分離法、稀釋分離法。劃線(xiàn)分離法稀釋分離法第九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日（四）篩選

這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過(guò)三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。第十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日（五）毒性試驗(yàn)

自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國(guó)家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無(wú)須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過(guò)兩年以上的毒性試驗(yàn)。第十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)培養(yǎng)分離

從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎(chǔ)的步驟。到目前為止，還沒(méi)有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個(gè)試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類(lèi)。在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類(lèi)的菌株；在工業(yè)微生物篩選過(guò)程中，應(yīng)及時(shí)調(diào)整檢測(cè)方法，以與各種不同類(lèi)型的生長(zhǎng)和代謝之微生物相適應(yīng)。第十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日一、成功的分離培養(yǎng)方法(1)認(rèn)真考它所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過(guò)程；(2)制訂初步的篩選標(biāo)準(zhǔn)；(3)將生態(tài)學(xué)方法運(yùn)用到分離和篩選過(guò)程。第十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日二、培養(yǎng)分離中要解決的問(wèn)題1、“分離什么和從哪里分離出?”

2、必須充分考慮所分離微生物的生產(chǎn)能力、生長(zhǎng)速度、生物群體培養(yǎng)和產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及其提純的難易和費(fèi)用，工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中穩(wěn)定性及遺傳操作的難易程度等。3、選擇適宜的培養(yǎng)分離方法和檢測(cè)方法。第十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日三、將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離的一般思路要點(diǎn)1．羅列出所要分離的微生物類(lèi)群；2．根據(jù)所采集樣本的各種生態(tài)參數(shù)，描述所要分離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地：3．將若干樣本分成若干類(lèi)型，如植物和植物各部，土壤(類(lèi)型和土層)、巖石、水、昆蟲(chóng)和發(fā)酵食品等；4．羅列出所要考察和測(cè)量的環(huán)境參數(shù)，如pH、鹽分、水分、氧化還原電勢(shì)及溫度等；第十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

5．列出生物系統(tǒng)中有用的自然底物，如森林土壤中的幾丁質(zhì)、葡萄表皮的果膠；

6．根據(jù)上述1-5項(xiàng)中所獲得的數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)分離方法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然浸出汁和培養(yǎng)條件；

7．用標(biāo)準(zhǔn)方法作對(duì)照來(lái)評(píng)價(jià)生態(tài)學(xué)分離方法；

8．根據(jù)待檢材料的生態(tài)參數(shù)需要，修改已知的方法；

9．運(yùn)用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選意義的微生物類(lèi)群。第十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日四、自然界中細(xì)菌的分離第十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

(一)采樣和采集方法為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細(xì)菌菌群，特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時(shí)，必須十分重視樣本的采集。樣本采集時(shí)所需的工具通常有無(wú)菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無(wú)菌小塑料袋和塑料瓶等。第十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日采樣的注意事項(xiàng)1、采樣時(shí)應(yīng)盡可能保持相對(duì)無(wú)菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類(lèi)及采集日期、地點(diǎn)以及采集地點(diǎn)的地理、生態(tài)參數(shù)等；4、應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時(shí)間因素，因?yàn)檎嬲脑鼐旱某霈F(xiàn)可能是短暫的；第十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日5、采好的樣應(yīng)及時(shí)處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4℃下，但貯存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。這是因?yàn)橐坏┎蓸咏Y(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來(lái)的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會(huì)發(fā)生變化，微生物群體之間就會(huì)出現(xiàn)消長(zhǎng)第二十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日1．土樣采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴(yán)格，可取離地面5～15cm處的土。將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根際土樣時(shí)，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量無(wú)菌水中浸漬約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無(wú)菌水漂洗下根部殘留的土，這部分上卻為根際土樣。第二十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日2．植物體采集方法

在采集葉面時(shí)，一般是用滅菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周?chē)吘?。選擇葉面時(shí)應(yīng)考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。采集植物根及根系時(shí)，方法與根際土樣采集方法相似。將洗凈的根裝入采樣袋中，采集根系時(shí)，一般與根際土樣一起保存。第二十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

3．水樣采集方法用于細(xì)菌檢測(cè)的水樣應(yīng)收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，故在采樣時(shí)應(yīng)在較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下打開(kāi)瓶蓋，讓水樣進(jìn)入。如果有急流存在的話(huà)，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。采集瓶從水中取出時(shí)應(yīng)迅速并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿(mǎn)采樣瓶。所有水樣都應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進(jìn)行檢測(cè)，或者4℃下貯存。第二十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日(二)生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基

的組成原則1、加入培養(yǎng)基中的天然提取物種類(lèi)和用量、環(huán)境生物物理學(xué)參數(shù)以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)中所要分離的細(xì)菌的數(shù)量和種類(lèi)。2、就分離培養(yǎng)基的組成而言，部分培養(yǎng)基中必須含有10-50%的天然提取物。加入培養(yǎng)基中的天然提取物，部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳、氮源，如幾丁質(zhì)、纖維素或果膠。第二十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日3、所有分離培養(yǎng)基中都應(yīng)含有抗真菌劑(如放線(xiàn)菌酮和制霉素)，摻加濃度一般為50μg／m1，以抑制真菌的生長(zhǎng)。4、瓊脂平板在使用前應(yīng)置于37℃培養(yǎng)箱中孵育l－2天。5、培養(yǎng)基的生物物理學(xué)參數(shù)，如pH及鹽分也應(yīng)調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。第二十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日土中細(xì)菌的富集培養(yǎng)與分離

分離土樣中的大部分細(xì)菌的分離程序中無(wú)需進(jìn)行富集。但對(duì)某些少數(shù)細(xì)菌則要求特殊的富集或選擇技術(shù)才能很好地被分離培養(yǎng)。第二十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日富集方法運(yùn)用細(xì)菌的酶誘導(dǎo)性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復(fù)雜底物及生長(zhǎng)因子的前體物質(zhì)來(lái)激活細(xì)菌某一特殊基因組，可以建立起若干富集技術(shù)。富集可以促進(jìn)抗性的產(chǎn)生并維持下來(lái)。第二十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日土樣中細(xì)菌的富集：適度稀釋后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如幾丁質(zhì)、纖維素等)的土浸出汁平板。植物體上細(xì)菌的分離：無(wú)菌富集，加植物浸出液適度培養(yǎng)取樣，洗滌，取1ml經(jīng)適度稀釋后涂布平板。水中細(xì)菌的分離：水樣通過(guò)0.22μm無(wú)菌濾膜，取出濾膜用1ml無(wú)菌稀釋液將濾膜上的沉積洗下。用樣本稀釋液適度稀釋,涂布平板倒置培養(yǎng)或?yàn)V紙壓印分離法。第二十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日水中細(xì)菌分離的簡(jiǎn)易富集技術(shù)

在無(wú)菌的、用棉團(tuán)塞好的廣口三角燒瓶中連續(xù)培養(yǎng)，定期取樣涂布適宜分離瓊脂平板上；在不同水體的水樣中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白質(zhì)等，同樣可以促進(jìn)水中微生物的增殖。培養(yǎng)過(guò)程中可加入低濃度的抗真菌劑以抑制真菌的生長(zhǎng)。另一富集方法是在培養(yǎng)燒瓶中添加細(xì)菌“附著材料”，如無(wú)菌的植物組織或土壤浸出液。通過(guò)改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細(xì)菌、中溫菌和嗜高溫菌。第二十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日次代培養(yǎng)及純化步驟1、涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后，如生長(zhǎng)出菌落，則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對(duì)瓊脂平板進(jìn)行分類(lèi)。2、用無(wú)菌牙簽將菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板上及轉(zhuǎn)接至添加有少量天然浸出液的適宜保藏瓊脂斜面上。3、篩選平板經(jīng)培養(yǎng)后，按生長(zhǎng)出菌落的形態(tài)學(xué)特征如色素、菌落形態(tài)等進(jìn)行最初分組。4、將認(rèn)為有希望的菌落用牙簽轉(zhuǎn)接到另一模擬分離瓊脂平板上進(jìn)行篩選。第三十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日五、放線(xiàn)菌的分離(一)采樣及采集方法應(yīng)盡可能實(shí)行無(wú)菌操作。所采集的樣本應(yīng)具有一定的代表性。樣本采集完后，應(yīng)及時(shí)處理或在4℃下貯存，貯存試樣處應(yīng)與劃線(xiàn)，篩選平板分開(kāi)，貯存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。第三十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

(二)生態(tài)學(xué)參數(shù)

放線(xiàn)菌分離培養(yǎng)過(guò)程中所需考慮的生態(tài)參數(shù)有溫度、pH、離子強(qiáng)度、氧化還原電勢(shì)和底物濃度。第三十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日（三）培養(yǎng)基的組成原則大多數(shù)放線(xiàn)菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的。除嗜溫性放線(xiàn)菌外，其他放線(xiàn)菌一般在培養(yǎng)4-20天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落。在放線(xiàn)菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線(xiàn)菌酮，以抑制真菌的繁殖。選擇性地添加抗生素。分離瓊脂平板制備好后，一般皆應(yīng)在37℃培養(yǎng)箱中存放3天。第三十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日放線(xiàn)菌的分離土樣中放線(xiàn)菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無(wú)菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。植物體上放線(xiàn)菌的分離：無(wú)菌取植物組織，干燥以減少細(xì)菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。水中放線(xiàn)菌的分離：為使所要分離的放線(xiàn)菌的數(shù)量種類(lèi)增多，一般將水樣離心或?yàn)V紙過(guò)濾，取離心沉積或?yàn)V紙表面沉積進(jìn)行系列稀釋和涂布。第三十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日次代培養(yǎng)及純化菌落形成后可根據(jù)肉眼可見(jiàn)的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。通過(guò)高倍放大進(jìn)行鏡檢，可了解氣生和營(yíng)養(yǎng)孢子形成情況。成功地分離出各種不同的放線(xiàn)菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識(shí)別不同的生長(zhǎng)形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線(xiàn)菌時(shí)顯得尤為重要。將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無(wú)菌牙簽挑取，點(diǎn)接到瓊脂平板上進(jìn)行影印培養(yǎng)，以進(jìn)一步篩選和分離。第三十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日六、真菌分離1、利用低碳／氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長(zhǎng)菌落分散，利于計(jì)數(shù)，分離和鑒定。這里主要是利用營(yíng)養(yǎng)成分的減少而使生長(zhǎng)減慢，并由此限制真菌的遷涉生長(zhǎng)。2、改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌的分離。3、有時(shí)，真菌子實(shí)體形成必須有光線(xiàn)，這在分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加以考慮。第三十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日4、選擇性富集：是通過(guò)一定的方式使樣本中一種或一群微生物數(shù)量上的增加而利于分離的一種技術(shù)。富集可以是種水平的，如通過(guò)營(yíng)養(yǎng)要求的改變來(lái)富集分離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。5、選擇性抑制培養(yǎng)基可使非目標(biāo)微生物消除或減少到一定程度。在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素即可有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及菌落形成。第三十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日真菌的分離方法土中真菌的分離：稀釋法，混入法，壓貼法，粘附法，浮選法，注射器采集法，土過(guò)篩法，庶糖密度梯度離心法。植物材料中真菌的分離：植入法，壓貼法，洗滌法，浸泡法。水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離。餌誘技術(shù)常用于水中真菌的富集。子實(shí)體直接分離培養(yǎng)擔(dān)子菌：新采集的子實(shí)體組織植入平板內(nèi)或在放于液體培養(yǎng)基表面放一小塊無(wú)菌濾紙上培養(yǎng)。第三十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日七、生產(chǎn)選種

是在長(zhǎng)年累月的生產(chǎn)實(shí)踐中，在培養(yǎng)工藝條件沒(méi)有任何可見(jiàn)變更情況下，突然發(fā)現(xiàn)某些批次生產(chǎn)水平提高較大，這就有可能是個(gè)別自然變異朝更好的方向變的細(xì)胞，在這種條件下很適應(yīng)于培養(yǎng)條件，并逐漸顯示出它的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，這種優(yōu)勢(shì)的發(fā)展，促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露。進(jìn)行類(lèi)似新種篩選分離，達(dá)到獲得新的優(yōu)良生產(chǎn)菌種的目的。第三十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)工業(yè)菌種的育種方針工業(yè)菌種的育種：是運(yùn)用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對(duì)某個(gè)用于特定生物技術(shù)目的的菌株進(jìn)行的多方位的改造。通過(guò)改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強(qiáng)化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。第四十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日工業(yè)菌種育種的方法誘變基因轉(zhuǎn)移基因重組第四十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日育種過(guò)程包括下列3個(gè)步驟：

(1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的選出。(3)改良菌種的評(píng)價(jià)(包括實(shí)驗(yàn)規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模)。第四十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日選擇育種方法時(shí)綜合考慮的因素

(1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn))；

(2)對(duì)這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)萬(wàn)面認(rèn)識(shí)的明了程度；

(3)經(jīng)濟(jì)費(fèi)用。如果對(duì)特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機(jī)誘變、篩選及選育等技術(shù)：如果對(duì)其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認(rèn)識(shí)，則可選擇基因重組等手段進(jìn)行定向育種。第四十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日工業(yè)菌種改良方法(1)解除或繞過(guò)代謝途徑中的限速步驟：通過(guò)增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達(dá)能力來(lái)提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個(gè)旁路代謝途徑。

(2)增加前體物的濃度。

(3)改變代謝途徑，減少無(wú)用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對(duì)高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。第四十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日(4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。(5)改進(jìn)菌種外泌產(chǎn)品的能力。(6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性。第四十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

提高特定基因的表達(dá)水平(1)引入強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)，可通過(guò)在一高效表達(dá)載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強(qiáng)啟動(dòng)子；修改現(xiàn)有表達(dá)信號(hào)，提高基因效力等。(2)誘導(dǎo)解除基因表達(dá)抑制的突變。第四十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

改進(jìn)菌種的生長(zhǎng)效率提高菌株對(duì)底物的利用率方法：

a.通過(guò)確定并改變代謝中的耗能部分;b.由另一菌株的高效低能代謝途徑代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)。

c.賦予菌種對(duì)多種底物，特別是價(jià)廉而豐富的底物的利用能力，由此可降低操作費(fèi)用。第四十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)誘變育種以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機(jī)率并不很高，一個(gè)基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國(guó)內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。第四十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日誘變物理、化學(xué)或生物誘變方法第四十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

一、誘變劑和誘變處理

物理誘變劑：射線(xiàn)如紫外線(xiàn)、X—射線(xiàn)、γ—射線(xiàn)，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線(xiàn)。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過(guò)紫外線(xiàn)，對(duì)于一般實(shí)驗(yàn)室、中小型工廠都適用，也很安全。其他的幾種射線(xiàn)都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專(zhuān)業(yè)人員在專(zhuān)門(mén)的設(shè)備中使用，否則有一定危險(xiǎn)性。第五十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日化學(xué)誘變劑：化學(xué)因子如堿基類(lèi)似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等。化學(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點(diǎn)：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。

第五十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日2、化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟(jì)的，因?yàn)橹恍枰倭康暮线m的誘變劑，設(shè)備是實(shí)驗(yàn)室的一般玻璃器皿，一個(gè)蒸氣罩。而用電離輻射±行工作時(shí)，設(shè)備費(fèi)用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，，且切勿吸入其蒸氣，有人對(duì)某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會(huì)過(guò)敏，這就更要當(dāng)心。第五十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日誘變劑的選擇1．堿基類(lèi)似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復(fù)突變率高，效果不大。2．亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱(chēng)為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。第五十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日3．吖啶類(lèi)誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4．紫外線(xiàn)仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。第五十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日二、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選第五十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日(一)出發(fā)菌株的選擇1．自然界新分離的野生型菌株，對(duì)誘變處理較敏感，容易達(dá)到好的效果。2．在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3．每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4．出發(fā)菌株開(kāi)始時(shí)可以同時(shí)選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。第五十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日5．要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來(lái)作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。

6．根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細(xì)胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因?yàn)橥徽T變劑的重復(fù)處理會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，就要選對(duì)數(shù)期的細(xì)胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。第五十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

(二)處理菌懸液的制備這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的、活力類(lèi)似的菌懸液，為此要進(jìn)行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過(guò)濾。第五十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日(三)誘變處理

根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對(duì)象的實(shí)際，設(shè)計(jì)誘變處理方案。第五十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

(四)中間培養(yǎng)

由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來(lái)之前，有一個(gè)表現(xiàn)延遲的過(guò)程，即細(xì)胞內(nèi)原有酶量的稀釋過(guò)程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來(lái)。這個(gè)過(guò)程對(duì)今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。第六十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

方法：讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時(shí)，以讓細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細(xì)胞繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。這樣，隱性的變異就會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會(huì)出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時(shí)存在于一個(gè)菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來(lái)的菌株退化。第六十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日(五)分離和篩選篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.

例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來(lái)挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再?gòu)?fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。第六十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日紫外線(xiàn)的誘變育種

紫外線(xiàn)誘變一般采用15W紫外線(xiàn)殺菌燈，波長(zhǎng)為2537A．燈與處理物的距離為15～30cm，照射時(shí)間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。第六十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日亞硝基胍誘變曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對(duì)真核或原核微生物都有強(qiáng)烈的誘變作用。其精確的作用機(jī)制尚不很清楚，據(jù)認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強(qiáng)。第六十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日第五節(jié)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指通過(guò)誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分才能正常生長(zhǎng)的變異株。與營(yíng)養(yǎng)缺陷型對(duì)應(yīng)的是野生型。第六十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日能滿(mǎn)足野生型菌株正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基稱(chēng)基本培養(yǎng)基(MM)；在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分的稱(chēng)補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM)；能滿(mǎn)足各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)的稱(chēng)完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。第六十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日營(yíng)養(yǎng)缺陷型的用途

營(yíng)養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類(lèi)型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。第六十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長(zhǎng)譜第六十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日一、誘變方法物理誘變化學(xué)誘變第六十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日二、淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生長(zhǎng)，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時(shí)讓野生型生長(zhǎng)，處于活化階段，而缺陷型無(wú)法生長(zhǎng)，仍處于休眠狀態(tài)。由于細(xì)菌或酵母對(duì)一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細(xì)菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過(guò)濾法：對(duì)于霉菌，因孢子生長(zhǎng)后會(huì)長(zhǎng)出菌絲體，就可用濾紙過(guò)濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過(guò)。第七十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

三、檢出缺陷型原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)情況完全不同，缺陷型在CM上生長(zhǎng)良好，而在MM上則不生長(zhǎng)，野生型都能生長(zhǎng)。具體方法：影印法、點(diǎn)種法、夾層法第七十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日1．將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。2．將完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標(biāo)記方位。3．將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上。

(一)影印法第七十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日4．將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。5．二平皿相同方位進(jìn)行比較，即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長(zhǎng)出的菌落少于GM平板上的。MM上未長(zhǎng)而相應(yīng)于CM上長(zhǎng)出的那幾個(gè)菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。第七十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

(二)點(diǎn)種法也就是任意法。用接種針或牙簽將CM上長(zhǎng)出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點(diǎn)種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況。此法結(jié)果明確，但工作量大。第七十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

(三)夾層法先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時(shí)第二批長(zhǎng)出的菌落就可能是缺陷型。此法缺點(diǎn)是，結(jié)果有時(shí)不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。第七十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日四、營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)譜的確定

驗(yàn)證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長(zhǎng)譜測(cè)定。第七十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日生長(zhǎng)譜測(cè)定的方法將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細(xì)胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50℃)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5～6個(gè)區(qū)間放上不同的營(yíng)養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營(yíng)養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會(huì)在某組合區(qū)長(zhǎng)出，就可測(cè)得所需營(yíng)養(yǎng)?！獋€(gè)平皿測(cè)一個(gè)菌。第七十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日以不同組合的營(yíng)養(yǎng)混合物與融化涼至50℃的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線(xiàn)接種各個(gè)缺陷型菌株于各相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長(zhǎng)出可推知其營(yíng)養(yǎng)因子。在5～6個(gè)平皿上可測(cè)20株菌以上。第七十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日第六節(jié)基因育種基因重組育種：是運(yùn)用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，或者通過(guò)細(xì)胞間的相互作用，使一個(gè)細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另—個(gè)細(xì)胞的方法。第七十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日第七節(jié)原生質(zhì)體育種

原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法。原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國(guó)際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會(huì)上提出來(lái)的。第八十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日一、開(kāi)發(fā)新的代謝產(chǎn)物的途徑

(1)從自然界分離新的微生物菌株，或采用新的檢閱方法篩選新的代謝產(chǎn)物。(2)對(duì)已知微生物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)修飾。(3)利用微生物轉(zhuǎn)化改造代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。

(4)通過(guò)原生質(zhì)體融合獲得新的代謝產(chǎn)物。(5)DNA重組技術(shù)。第八節(jié)篩選新的代謝產(chǎn)物

第八十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日二、篩選微生物新的代謝產(chǎn)物的程序

第八十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日突變型菌株的篩選

一、產(chǎn)量性狀突變株的篩選第八十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

三、篩選微生物代謝產(chǎn)物的目標(biāo)

篩選克服抗生素抗性菌株的活性物質(zhì)；篩選抗腫瘤、抗病毒的活性物質(zhì)；研究有藥理活性的酶抑制劑及免疫調(diào)節(jié)劑；尋找食品工業(yè)最好的酵母培養(yǎng)物；篩選降解有害物質(zhì)的微生物以及治療上具有低毒、長(zhǎng)效的化學(xué)藥物等。

第八十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日四、篩選微生物代謝產(chǎn)物的方法

(一)直接方法為了盡快確定微生物代謝產(chǎn)物的利用前途，在體外試驗(yàn)測(cè)得活性后，可以將培養(yǎng)液的有效成分直接作用于機(jī)體，觀察被測(cè)樣品的療效。這種直接確定代謝產(chǎn)物用途的方法亦稱(chēng)動(dòng)物體內(nèi)治療試驗(yàn)。第八十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日第八十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日(二)間接方法篩選醫(yī)用抗生素，可用細(xì)茵、真菌、病毒或腫瘤模型，尋找抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤抗生素、酶抑制劑、免疫制劑等有效物質(zhì)。在預(yù)篩選時(shí)，多用瓊脂平扳擴(kuò)散抑菌法。通過(guò)預(yù)篩選，直接測(cè)定最初分離物的生物活性，能加速篩選過(guò)程。

第八十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日

五、檢測(cè)系統(tǒng)

篩選過(guò)程的成功依賴(lài)于排除那些已知的或并非需要的代謝產(chǎn)物的檢驗(yàn)方法，這樣才能識(shí)別出人們需要的化合物。第八十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日性能簽別

性能鑒別是分離和篩選微生物代謝產(chǎn)物中最基礎(chǔ)的工作。鑒別可分為兩方面：

①對(duì)微生物方面進(jìn)行形態(tài)、培養(yǎng)、生化功能答試驗(yàn)觀察，并確定微生物產(chǎn)生菌的類(lèi)群；②從化學(xué)的早期鑒別來(lái)鑒別微生物的代謝產(chǎn)物?；瘜W(xué)的早期鑒別一般對(duì)產(chǎn)生菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行紙上層析、薄板層析、紙上電泳、抗茵譜、高壓電泳、紫外分光光度法、液相和氣相色譜等試驗(yàn)，井獲得各種圖譜，與已知圖譜進(jìn)行比較鑒別。

第八十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日如果認(rèn)為是有實(shí)用前途的代謝產(chǎn)物，則要進(jìn)一步大量培養(yǎng)，并進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)、毒性考查、藥物代謝等實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行提高發(fā)酵水平和改善提取工藝的工作，以備投入生產(chǎn)。如果是新的代謝產(chǎn)物．一般要進(jìn)一步確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，井在此基礎(chǔ)上進(jìn)行合成法的研究或進(jìn)行化學(xué)改造，研究結(jié)構(gòu)與生物活性的相互關(guān)系，并對(duì)作用機(jī)制、生物合成過(guò)程作進(jìn)一步的研究。第九十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日第十節(jié)工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的某一期待代謝產(chǎn)物主能力的微生物菌種的保存和長(zhǎng)期保藏，對(duì)于一成功的工業(yè)發(fā)酵過(guò)程極為重要。第九十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件(1)

經(jīng)長(zhǎng)期保藏后菌種存活健在；(2)

保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。(3)菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。第九十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

(1)冷凍干燥或真空干燥保藏；

(2)超低溫或在液氮中冷凍保藏；

(3)

轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?/p>

(4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。第九十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日2.1

冷凍保藏

冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡(jiǎn)單而有效的方法。通過(guò)冷凍，使微生物代謝活動(dòng)停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿(mǎn)意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑。冷凍保藏時(shí)溫度要求在-20℃以下，同時(shí)應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變。冷凍深藏的缺點(diǎn)之一是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。第九十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日冷凍保藏種類(lèi)

一、普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)三、液氮冷凍保藏技術(shù)

第九十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中?；蛘撸瑢⒕N培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長(zhǎng)適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。第九十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日應(yīng)注意的是經(jīng)過(guò)一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來(lái)保藏。保藏過(guò)程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。這一方法雖簡(jiǎn)便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長(zhǎng)期保藏。第九十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)要求長(zhǎng)期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60℃以下進(jìn)行保藏。一般方法：1．離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞；2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。第九十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日三、液氮冷凍保藏技術(shù)

(一)冷凍保護(hù)劑

在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油—般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過(guò)濾滅菌。

第九十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日(二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟

1．待冷凍保藏菌種懸液的制備

(1)從生長(zhǎng)斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10％甘油的營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.5～lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專(zhuān)用塑料瓶，

第一百頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日(2)從浸沒(méi)培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒(méi)培養(yǎng)液中加入等體積20%無(wú)菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專(zhuān)用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。第一百零一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日2．控速冷凍．(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對(duì)溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30℃)；(4)補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡可能快地發(fā)生相變；第一百零二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28日(5)細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達(dá)-50℃；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96℃)或氣相(-156℃)中保存。如果無(wú)控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。第一百零三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，2022年，8月28