酶的發酵工程

EnzymeEngineering1.酶生物合成的調節機制2.酶的微生物發酵技術3.酶發酵動力學

酶的發酵工程

EnzymeEngineering第一節酶生物合成的調節機制1、原核生物中酶生物合成的調節

原核生物酶的合成主要是在轉錄水平上進行調節，調節方式主要有酶合成的誘導和酶合成的阻遏兩種方式。

原核生物中酶合成的誘導和阻遏作用機制都可以用Jacob和Monod提出的操縱子理論來解釋。1、原核生物中酶生物合成的調節

（一）乳糖操縱子學說1.基本概念操縱子：由調節基因（R）、啟動子（P）、操縱基因（O）和結構基因（S）所構成的一個完整的基因表達單位。誘導物：誘導酶起始合成的物質。輔阻遏物：阻遏酶產生的物質。調節蛋白：調節基因產生的一種變構蛋白。兩個結合位點：操縱基因結合位點、效應物結合位點。兩種類型：阻遏蛋白、阻遏蛋白原。（1）阻遏蛋白的負性調節IPOZYAβ-半乳糖苷酶透過酶乙?；D移酶誘導物阻遏蛋白cAMP-CAPRNA聚合酶mRNA（2）CAP的正性調節

DNA1、原核生物中酶生物合成的調節（二）色氨酸操縱子學說磷酸核糖鄰氨基苯甲酸分支酸鄰氨基苯甲酸羧苯氨基脫氧核糖磷酸吲哚甘油磷酸色氨酸鄰氨基苯甲酸合酶鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉移酶磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶吲哚甘油磷酸合酶色氨酸合酶1、原核生物中酶生物合成的調節1.操縱子的調節作用RPODBACE阻遏蛋白原輔阻遏物（色氨酸）mRNADNA1、原核生物中酶生物合成的調節

2.衰減子的調節作用RPODBACE低色氨酸高色氨酸前導序列4321DNA12435/

-mRNAPr43211、原核生物中酶生物合成的調節1、原核生物中酶生物合成的調節

（三）酶生物合成的誘導作用酶的合成方式：組成酶：細胞所固有的酶誘導酶：在誘導物的誘導作用下合成的酶誘導物—底物、產物、底物結構類似物（IPTG）誘導作用協同誘導：誘導物同時誘導幾種酶的合成順序誘導：先后誘導不同酶的合成生物學意義：①

節約機制；②

環境適應能力（四）酶生物合成的阻遏作用1.終產物阻遏

某一代謝（合成）途徑的終產物阻遏合成途徑中酶的合成的現象。ABCDEE1E2E3E41、原核生物中酶生物合成的調節1、原核生物中酶生物合成的調節

2.分解代謝物的阻遏作用當培養基中存在兩種碳源（底物）時，容易利用的碳源的分解代謝產物阻遏分解代謝另一種碳源的酶的合成的現象。葡萄糖效應：葡萄糖抑制微生物利用其他碳源（底物）的現象

。2、真核生物中酶生物合成的調節

（一）細胞分化改變酶的生物合成如：端粒酶的生物合成（二）基因擴增加速酶的生物合成

如：爪蟾卵細胞形成時，rRNA的基因數增加4000倍；中國田鼠細胞培養在含有氨甲基蝶呤的培養基中生長時，細胞中編碼二氫葉酸還原酶的基因大量擴增，以合成大量的二氫葉酸還原酶。2、真核生物中酶生物合成的調節

（三）增強子促進酶的生物合成

增強子：是一段能夠提高轉錄效率的特定DNA序列，長約100~200bp，核心組件8~12bp，單拷貝或多拷貝串聯存在。增強子的作用特點：（1）提高同一條DNA鏈上基因的轉錄效率，可遠距離發揮作用，在基因的上游或下游均可起作用。（2）與其序列的正反方向無關。（3）要有啟動子才能發揮作用，但對啟動子沒有嚴格的專一性。（4）必須與特定的蛋白質因子結合才能發揮作用，具有組織和細胞特異性。3、酶生物合成調節作用機理應用

（一）發酵中的應用枯草芽胞桿菌的鳥苷發酵是典型的代謝控制發酵，采用腺嘌呤營養缺陷型突變株。發酵過程中人為限制腺嘌呤濃度，使細胞代謝途徑中的腺嘌呤類核苷酸濃度保持在不致引起關鍵酶的反饋抑制和阻遏的水平，有利于鳥苷的積累?？莶菅堪麠U菌5’-二磷酸鳥苷二鈉3、酶生物合成調節作用機理應用

（二）誘導酶生產中的應用在培養基中加入誘導物誘導酶合成的例子非常多，食品和飼料工業中應用的酶如：α-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、植酸酶、葡萄糖異構酶、β-半乳糖苷酶，它們均屬于誘導酶，在酶的合成時必須在培養基中加入底物或底物類似物等誘導物時才會產酶。酶結構、誘導酶3、酶生物合成調節作用機理應用

（三）微生物選育中的應用若通過基因工程手段和傳統誘變的技術獲得在抗代謝物（代謝物的結構類似物）存在時也能正常生長的突變株，則說明該突變株的相關酶系對這種抗代謝物不敏感，這也就解除了某些代謝物對有關酶系的反饋阻遏。通過基因工程手段的農作物酶的發酵工程

EnzymeEngineering第二節酶的微生物發酵技術

利用微生物的發酵作用，運用一些技術手段控制發酵過程，大規模產酶的技術，稱為酶的發酵技術。內容主要包括：菌種的選育、培養基的配置、培養條件控制、發酵方法。酶的微生物發酵技術

1、酶的生產菌種（一）產酶微生物的種類1、細菌大腸桿菌（E.coli）一般產胞內酶主要的酶品種谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、青霉素?；傅然蚬こ滩僮髅福合拗菩詢惹忻浮NA聚合酶、DNA連接酶等

枯草桿菌（B.subtilis）能產生多種胞外酶主要的酶品種淀粉酶類：如-淀粉酶（胞外）蛋白酶類：如中性蛋白酶（胞外）磷酸酶類：堿性磷酸酶（細胞間質）、5’-核苷酸酶等1、酶的生產菌種

（一）產酶微生物的種類2.放線菌鏈霉菌（Streptomyces）生產葡萄糖異構酶的主要微生物主要酶品種青霉素?；浮⒗w維素酶、幾丁質酶、堿性/中性蛋白酶等含有豐富的16-羥化酶用于甾體藥物轉化1、酶的生產菌種

（一）產酶微生物的種類3.酵母菌假絲酵母屬（Candida）細胞呈圓形、卵形或長形不產色素，在麥芽汁瓊脂培養基上

菌落乳白色或奶油色產酶品種脂肪酶、尿酸酶、轉化酶、醇脫氫酶等產17-羥化酶用于甾體藥物轉化具烷類代謝的酶系可利用石油及其加工廢料為碳源1、酶的生產菌種

啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）廣泛應用于食品工業細胞呈圓形、卵形、橢圓形，在麥芽汁培養基上菌落白色有光澤產酶品種醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶、轉化酶等1、酶的生產菌種

（一）產酶微生物的種類4.霉菌：黑曲霉（Aspergillusniger）主要酶品種糖化酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纖維素酶等米曲霉（Aspergillusoryzae）米曲霉中糖化酶和蛋白酶活力較強，因此廣泛應用于釀造行業和食品行業主要酶品種糖化酶、果膠酶、氨基?；?、磷酸二酯酶、核酸酶等1、酶的生產菌種

1、酶的生產菌種黑曲霉（A.niger）米曲霉（A.oryzae）

紅曲霉屬（Monascus）菌落成熟后產紅色色素，顏色較深腐生真菌，能耐受pH3.5和10%酒精，尤嗜乳酸紅曲霉中含有豐富的酶系，并且自身能合成生長素，無須外源

供給，尤其是葡萄糖淀粉酶和蛋白酶等酶，在食品行業使用廣泛主要酶品種-淀粉酶、糖化酶、麥芽糖酶、酯酶等1、酶的生產菌種

青霉屬（Penicillium）屬半知菌綱，也有的列入子囊菌綱腐生真菌，存在于空氣中及腐爛的物質表面常用的工業發酵微生物，廣泛用于有機酸、干酪和抗生素的生產主要菌種和酶的種類產黃青霉（Penicilliumchrysogenum）葡萄糖氧化酶、纖維素酶、果膠酶、青霉素酰化酶等橘青霉（Penicilliumcitrinum）脂肪酶、葡萄糖氧化酶、5’-磷酸二酯酶、核酸酶等1、酶的生產菌種

青霉屬（Penicillium）1、酶的生產菌種

木霉（Trichoderma）屬于半知菌亞門，叢梗孢目，木霉屬，常見的木霉有綠色木霉、康寧木霉等木霉具有較強分解纖維素能力，綠色木霉（T.viride）通常能夠分泌高活性纖維素酶，對纖維素的分解能力很強，因此在木質素、纖維素豐富的基質上生長快，傳播蔓延迅速菌落開始時為白色，致密，圓形，向四周擴展最后整個菌落全部變成綠色產纖維素酶

的重要菌株；亦用于生產17-羥化酶，可用于甾體藥物轉化1、酶的生產菌種

木霉（Trichoderma）木霉適應性很強，菌落擴展很快，特別在高溫高濕度條件下幾天內木霉菌落可遍布整個料面1、酶的生產菌種哈茨木霉(T.harzianum)的顯微形態綠色木霉(T.viride)的菌落

根霉（Rhizopus）具有11-羥化酶，是用于甾體藥物轉化的重要菌株產酶品種糖化酶、蔗糖酶、堿性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等毛霉（Mucor）毛霉能糖化淀粉并能生成少量乙醇，產生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我國多用來做豆腐乳、豆豉許多毛霉能產生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等產酶品種蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等1、酶的生產菌種

根霉（Rhizopus）毛霉（Mucor）1、酶的生產菌種

（二）產酶菌種的要求（1）酶的產量高；（2）容易培養和管理，產酶細胞容易生長繁殖，適應性強，便于管理；（3）菌株遺傳性能穩定，不易變異退化，不易感染噬菌體，保證生產的穩定性；（4）菌株能利用廉價原料，發酵周期短，生產成本低；（5）有利于酶產品的分離純化，最好是分泌型的胞外酶；（6）菌株安全可靠，非病原菌，不產毒素及其它有害物質，不影響生產人員的身體健康；1、酶的生產菌種

（三）菌種篩選1.含菌樣品的采集根據不同微生物的生態分布特點，從自然界中采樣。產酶微生物的分布基本規律：（1）相近菌種產生的酶性質一般相近或相似。（2）胞外酶的穩定性和最適條件通常和菌的最適生長條件接近（3）為獲得能降解某種物質的產酶菌株，一般可從該物質分布比較豐富的地方尋找。1、酶的生產菌種

（三）菌種篩選2.菌種的分離純化平板劃線法、稀釋涂布分離法3.產酶性能的測定初篩：快速、簡便；平板篩選法—有色圈。復篩：精確；液體或固體培養發酵，測定產酶水平。1、酶的生產菌種

（三）菌種篩選4.菌種的選育（1）誘變育種物理誘變：紫外線、γ射線、微波誘變等化學誘變：亞硝基胍（NTG）、硫酸二乙酯（DES）等空間誘變（特殊環境條件，如宇宙射線、高真空、微重力等）（2）代謝控制育種營養缺陷型突變株、抗反饋調節突變株、耐性突變株（3）原生質體融合育種親株細胞分別去除細胞壁后進行融合,基因組間交換重組,獲得融合子1、酶的生產菌種

（三）菌種篩選（4）基因工程育種是在分子水平上對基因進行操作的復雜技術，將外源基因通過體外重組后導入受體細胞內，使這個基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯表達的操作。（5）基因組改組育種是分子定向進化—DNA改組技術在全基因組水平的延伸。它將重組的對象從單個基因擴展到整個基因組，可以在更廣泛的范圍內對菌種的多種優良性狀進行優化組合。1、酶的生產菌種

（三）菌種篩選5.菌種的保藏斜面低溫保藏法、沙土管保藏法、石蠟油封藏法、真空冷凍干燥法、超低溫保藏法、固體曲法等。6.菌種的退化與復壯（1）菌種退化現象：隨著菌種保藏時間的延長或多次的轉接傳代，菌種本身所具有的優良遺傳性狀發生了不利于發酵生產的遺傳變異現象。（2）防止退化措施：創造合適的培養條件，采取有效的菌種保藏方法，盡量減少傳代次數。（3）退化菌種的復壯：純種分離和性能測定。1、酶的生產菌種

（四）菌種活化與擴大培養1.菌種擴大培養保藏菌種試管斜面活化三角瓶培養種子罐培養2.種子制備的過程防止雜菌污染，減少轉接次數，避免種子培養基的長時高溫滅菌；培養基及培養條件是細胞生長繁殖的最適條件；培養時間以對數生長期為宜。1、酶的生產菌種

（四）菌種活化與擴大培養3.種子質量的控制（1）影響種子質量的因素及其控制培養基營養成分豐富，盡可能滿足細胞生長繁殖；營養成分盡可能與發酵培養基接近；pH值穩定培養條件必須是菌種細胞生長繁殖的最適條件；包括溫度、pH值、通氣攪拌、通風、翻曲、濕度種齡生命力最為旺盛的對數生長期。細菌：7~24h;

霉菌：16~50h;

放線菌：21~64h;1、酶的生產菌種

（四）菌種活化與擴大培養3.種子質量的控制接種量與菌種特性、種子質量和發酵條件有關。種子質量的判斷

細菌、酵母菌——

菌體健壯，菌形一致，均勻整齊，一定的排列和形態；

霉菌、放線菌——菌絲粗壯，染色力強，生長旺盛，菌絲分枝和內含物情況良好。種子的異常情況菌種生長緩慢或過快，菌絲結團1、酶的生產菌種

（四）菌種活化與擴大培養3.種子質量的控制（2）種子質量的控制措施菌種穩定性檢查：保藏菌種無（雜）菌檢查：顯微鏡觀察，肉湯或瓊脂斜面培養生化分析：養分消耗速度，pH變化，溶解氧利用，色澤，

氣味等1、酶的生產菌種

（一）培養基成分對產酶的影響1.碳源淀粉及其水解物,可作為產酶誘導物2.氮源無機氮和有機氮3.無機鹽類大量元素和微量元素4.生長因子氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素、激素5.產酶促進劑表面活性劑、植酸鈣鎂、LS(脂肪酰胺磺酸鈉)聚乙烯醇、EDTA等2、培養基和培養條件對產酶影響與調節

1.pH對產酶的影響與調節控制細菌、放線菌中性至微堿性；霉菌、酵母菌：微酸性培養基pH的改變會影響產酶的種類和比例調節控制控制培養基的組分或比例；添加pH緩沖物種；流加酸堿溶液或補料；提高空氣流量2、培養基和培養條件對產酶影響與調節

2.溫度對產酶的影響與調節控制不同的微生物生長與產酶的最適溫度各不不同；很多微生物發酵產酶的最適溫度與生長繁殖的最適溫度不同，且往往低于生長最適溫度。在酶發酵生產的不同階段控制不同的溫度條件，進行變溫發酵。例如有報道，以枯草芽胞桿菌進行中性蛋白酶生產時，培養溫度從31℃逐漸升溫至40℃，然后再降溫至31℃進行培養，蛋白酶產量比不升溫時提高66％。2、培養基和培養條件對產酶影響與調節

2.溫度對產酶的影響與調節控制調節控制液態發酵可利用發酵罐的夾套、盤管或蛇管等通過溫（冷）水進行調節控制，固態發酵可通過通風量或風溫來進行調節。2、培養基和培養條件對產酶影響與調節溫度調節裝置

3.溶解氧對產酶的影響與調節控制臨界氧濃度——不影響細胞正常代謝的最低氧濃度溶氧濃度是溶氧濃度是由溶氧速率和耗氧速率來決定的。調節控制①

調節氧分壓改變進氣壓力或罐壓，改變氧含量，添加氧載體②

增加通氣量③延長氣液接觸時間，增加氣液接觸面積④

改變培養液的性質改變組分或濃度，添加消泡劑2、培養基和培養條件對產酶影響與調節

4.泡沫對產酶的影響與控制泡沫的不利影響：①

阻礙CO2的排除，影響O2的溶解；②

發酵液溢出，造成原料浪費，引起雜菌污染；③

發酵罐裝料量受限，降低發酵罐的利用率；控制泡沫的方法：①

選育不易產生泡沫的菌種；②

調節培養基中營養成分，減少或緩加易起泡的原料；③

機械消泡或化學消泡；化學消泡劑：天然油類，甘油聚醚，泡敵（聚環氧丙烷環氧乙烷甘油）。勤加、少加較好2、培養基和培養條件對產酶影響與調節

5.濕度對產酶的影響與控制對固體發酵產酶而言，影響微生物的產酶量，也會影響產酶達到高峰的時間。特定菌種，發酵過程的不同時期，對濕度要求不同。固態發酵產酶，前期濕度低，后期濕度高，有利于產酶。配制培養基時，控制物料的含水量；控制鼓風量大小，或調節空氣的濕度；噴灑水分2、培養基和培養條件對產酶影響與調節調節控制

按發酵基質狀態分為：（一）液體深層發酵3、發酵方法

優點：①

產酶純度高，質量穩定；②

較易控制發酵條件，易自動化控制；③

機械化程度高，勞動強度??；④

設備利用率高。

缺點：設備投資大

按發酵基質狀態分為：（二）固體發酵固體發酵方式：淺盤培養、轉鼓培養、厚層通風培養、壓力脈動固態發酵（新）3、發酵方法優點：設備簡單，環境污染少；產酶率高；適合霉菌的培養。缺點：勞動強度大；原料利用率低；產酶純度差，提取精制困難；傳質傳熱效率低，發酵條件不易控制，產酶不穩定；不能進行胞內酶的生產。

3、發酵方法固體發酵

按發酵基質狀態分為：壓力脈動固態發酵壓力脈動反應器的固體培養基是靜態,氣相則是動態，且氣體呈脈動式通入。優點實現了嚴格意義上的純種培養，提高了產酶效率實現發酵過程中的溫度、濕度、pH值可控。缺點設備投資比傳統固態發酵法高,但又比液體深層發酵低。3、發酵方法

3、發酵方法壓力脈動固態發酵

按物料交換情況分為以下幾種：（三）分批發酵

特點：操作簡單；發酵初期營養物過多可能抑制微生物的生長，中后期可能因為營養物的減少及有害代謝產物的積累而降低培養效率（四）連續發酵

優點：可有效實現自動化，降低勞動強度，設備利用率高，可消除反饋阻遏作用，酶產率高。適合于與生長相偶聯的發酵產物的生產。缺點：易變異退化，易染雜菌。原料利用率低，生產成本增加。3、發酵方法

按物料交換情況分為以下幾種：（五）補料分批發酵優點可解除營養基質的抑制和分解代謝物阻遏作用可改善好氧發酵的溶氧狀況減少菌體生成量，提高有用產物的轉化率菌絲減少可降低發酵液的粘度，便于發酵培養物的輸送及后處理不易產生菌種退化和變異，雜菌污染易控制