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文檔簡介

常用測定細胞增殖能力的實驗方法：MTT比色試驗、克隆形成試驗常用測定細胞增殖能力的實驗方法活細胞計數法：費時，有一定主觀性MTT比色法：簡便，大樣本、靈敏度較高，重復性好結晶紫染色法：與MTT法類似，但步驟多克隆形成法：反映干細胞增殖能力，周期長流式細胞術：細胞周期分布，成本高同位素摻入法：3H-TdR,125I-UdR摻入DNA，反映S期細胞活性，精度最高，但有放射性ATP生物發光法：靈敏度高，與MTT法類似MTT比色試驗原理MTT比色試驗步驟接種:細胞密度103~105/ml,體積100~200l培養:37℃、5％CO2、飽和濕度，培養24h施加干預因素：培養適當時間（1-5d）呈色:終止培養前4～6h，每孔加5mg/mlMTT20l，繼續培養溶解:每孔加DMSO150l，振蕩5min比色:492nm波長，測定光吸收值（A）繪制曲線：以細胞數或作用因素（如藥物濃度）為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制曲線MTTASSAYCellsuspension105/ml3.2×104/ml104/ml0.32ml0.1mlMedium0.68ml0.1ml0.9ml0.9ml3.2×103/ml3.2×105/ml0.9ml0.1mlMTTASSAYMTTASSAY

103

3.2×1033.2×104

104105

MTT比色試驗注意事項培養板：貼壁型細胞－平底培養板懸浮型細胞－U型培養板細胞密度：不同細胞須選擇適當的密度MTT溶液：4℃避光保存，出現結晶時棄去；部分細胞需摸索MTT作用最佳濃度和時間殘留血清和培養液會影響吸光值注意控制吸光值與細胞數之間線性范圍，一般為102～105MTT比色試驗應用舉例藥物敏感性試驗生物材料細胞毒測定放射效應測定冷凍殺傷效應測定高溫殺傷效應測定激光效應測定磁場效應測定補體依賴性細胞毒測定克隆形成試驗概念：克隆指單個細胞在體外持續分裂繁殖6代以上，其后代所組成的細胞群。光鏡下，大于50個細胞，計數為1個克隆。方法：1.平皿克隆形成試驗:適用于貼壁型細胞，如正常細胞或腫瘤細胞；控制細胞遷移2.軟瓊脂克隆形成試驗:適用于腫瘤細胞、轉化細胞和懸浮生長細胞；無細胞遷移；底層為0.5%瓊脂，上層為0.3%瓊脂(含細胞)。用途：多用于藥物、放射敏感性試驗。平皿克隆形成試驗軟瓊脂克隆形成試驗MTT實驗實習2人為1組，每塊96孔板共4人操作預先接種細胞數:103、3.2×103、104、3.2×104、105/0.2ml/孔預先常規培養預先加入MTT0.02ml,孵育6h吸出上清液，加入DMSO0.2ml,振蕩5`490nm比色，手工記錄吸光值

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