外源基因的原核表達系統第一頁，共三十五頁，2022年，8月28日提高外源基因表達水平的措施提高外源基因的表達效率，一般要考慮以下幾個原則1.優化表達載體的設計在構建表達載體時，對決定轉錄起始的啟動子序列和決定mRNA翻譯的SD序列進行優化，要求SD序列與翻譯起始位點AUG的距離要合適，這樣才能獲得目的蛋白的高水平表達。2.避免使用稀有密碼子密碼子具有簡并性，大腸桿菌基因對某些密碼子的使用表現出較大的偏愛性，同義密碼子使用的頻率與細胞內相應的tRNA的豐度正相關，稀有密碼子的豐度極低。在mRNA的翻譯過程中，往往會由于外源基因中含有過多的稀有密碼子而使細胞內稀有密碼子的tRNA供不應求，最終造成翻譯終止或移碼突變。第二頁，共三十五頁，2022年，8月28日3.提高外源基因mRNA的穩定性多數情況下，細菌的mRNA的半衰期很短，而外源基因mRNA的半衰期更短，若能增加外源mRNA的穩定性，就有可能提高外源基因的表達水平。4.提高表達蛋白的穩定性，防止其降解原核細胞中外源蛋白往往不夠穩定，易被蛋白酶降解從而使蛋白質產量降低。采取措施提高目的蛋白的穩定性，減少目標蛋白的降解從而提高目的基因的表達水平。第三頁，共三十五頁，2022年，8月28日5.減輕細胞的代謝負荷，提高外源基因的表達水平外源基因在宿主細胞內過度表達，必然影響宿主細胞的生長和代謝，而宿主細胞的代謝失常又會影響目標蛋白的表達。采取誘導表達和講宿主菌生長和表達質粒的復制分開等方式，平衡宿主細胞生長于目標蛋白表達這二者之間的矛盾。6.優化發酵條件在進行工業化生產時，工程菌株在大規模培養時培養條件的優化控制對外源基因的高效表達至關重要。優化發酵過程既包括工藝方面的因素，也包括生物方面的因素。第四頁，共三十五頁，2022年，8月28日利用原核表達系統生產真核蛋白質的實例干擾素基因工程

干擾素是一類多功能蛋白質，具有抗病毒、抗腫瘤、抗細胞分裂以及調節免疫功能的作用，因而通過基因工程生產干擾素具有重要的意義。

人的干擾素有3類：（α）白細胞干擾素、（β）成纖維素干擾素、（γ）免疫干擾素。目前，白細胞干擾素和成纖維素干擾素基因的結構基本了解：5’端有一段非翻譯序列，緊接著一段先導序列，其后是干擾素基因，編碼166個氨基酸，再后是3’非翻譯區，末端是多聚A。第五頁，共三十五頁，2022年，8月28日IFN-cDNA的制備分級分離把不同部分的mRNA分別注射到爪蟾卵母細胞中從誘發產生干擾素的白細胞中提取mRNA檢測干擾素抗病毒活性活性最高的mRNA反轉錄成cDNA第六頁，共三十五頁，2022年，8月28日IFN-cDNA的修飾在cDNA兩端連接EcoRI識別序列，并在5’端連上信號序列。IFN-cDNA克隆修飾的cDNA與表達載體pBR322或YEpIpT連接，形成重組載體，轉化大腸桿菌，表達分泌干擾素。我國科技工作者研制干擾素領域已獲得成功，通過基因工程生產的人αI型干擾素已于1990年正式投放市場。第七頁，共三十五頁，2022年，8月28日生長激素基因工程

人生長激素來自垂體，作為藥物可以用于治療兒童的侏儒癥、燒傷、傷口愈合，以及預防老年患者肌肉萎縮等。前體生長激素的N端有一段23個氨基酸的信號肽，去掉信號肽之后就可以成為成熟的生長激素。

在體外人工合成了起始密碼ATG與編碼前1-23個氨基酸的DNA片段并用反轉錄酶法合成了編碼24-191個氨基酸的DNA序列，將兩者連接后，轉入大腸桿菌成功表達。第八頁，共三十五頁，2022年，8月28日hGH編碼的前24個氨基酸的DNA片段克隆先人工合成6個小片段U1-U6，再依次將6個片段連接為一個較大的片段，該片段兩端分別為EcoRI和HindIII黏性末端。利用酶切位點與pBR322相連，形成重組載體，轉化大腸桿菌進行擴增。hGH編碼24-191個氨基酸的DAN片段克隆利用反轉錄酶法，從人垂體提取mRNA反轉錄成cDNA，再合成第二鏈，用HaeIII切割，利用瓊脂糖凝膠電泳分離純化551bp的DNA片段，經末端轉移酶的作用在3’端加入多聚C尾，再在pBR322上加入多聚G尾，使二者重組，對大腸桿菌進行轉化，擴增。hGH基因的克隆將兩部所得質粒酶切，連接，重組到含有LacUR-5啟動子和四環素標記的載體上，轉化大腸桿菌，篩選，表達。第九頁，共三十五頁，2022年，8月28日生長激素釋放抑制因子基因工程生長激素釋放抑制因子來自哺乳動物的下丘腦。主要抑制生長素、胰島素、胰高血糖素等多種激素的產生，可以用于治療肢端肥大癥、胰腺炎、糖尿病等。將人工合成的生長激素釋放抑制因子基因連在pBR322上并加上了乳糖操縱子調控，重組分子含有氨芐青霉素抗性以及乳糖發酵標記。基因產物不易被細胞內源性酶消化。將人工合成的生長激素抑制因子基因轉進大腸桿菌細胞，并得到了基因產物，這是人類首次實現了真核基因在原核細胞中的表達。第十頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素基因工程

胰島素是一種蛋白質類激素,體內胰島素是由胰島β細胞分泌的。在人體十二指腸旁邊，有一條長形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布著許許多多的細胞群，叫做胰島。胰島素是由胰島β細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質激素。胰島素是機體內唯一降低血糖的激素，也是唯一同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成的激素。作用機理屬于受體酪氨酸激酶機制。第十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素這類活性蛋白多肽和細胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立體結構異常復雜，體外難以人工合成。

所以過去糖尿病患者只能服用從牛、豬體中提取的胰島素來治療；但牛、豬胰島素結構上與人胰島素有差別，如與豬胰島素B鏈第30個基酸殘基不同，長期服用會引起腎和眼的疾病，故必需要用基因工程方法獲得重組人胰島素進行治療。胰島素由A、B兩個肽鏈組成。人胰島素A鏈有11種21個氨基酸，B鏈有15種30個氨基酸，共26種51個氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。此外A鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個二硫鍵。第十二頁，共三十五頁，2022年，8月28日第十三頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素立體結構第十四頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素的性質

〖化學本質〗蛋白質

〖分子式〗C257H383N65O77S6

〖分子量〗5807.69

〖性狀〗白色或類白色的結晶粉末

〖熔點〗233℃（分解）

〖比旋度〗-64°±8°(C=2,0.003mol/LNaOH)

〖溶解性〗在水、乙醇、氯仿或乙醚中幾乎不溶；在礦酸（無機酸）或氫氧化堿溶液中易溶

〖酸堿性〗兩性，等電點pI5.35-5.45

胰島素的英文縮寫，INS.（insulin）第十五頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.貝斯特首先發現1955年英國F.桑格小組測定了牛胰島素的全部氨基酸序列1965年9月17日，中國科學家人工合成了具有全部生物活力的結晶牛胰島素，它是第一個在實驗室中用人工方法合成的蛋白質胰島細胞根據其分泌激素的功能分為以下幾種：①B細胞(β細胞)，約占胰島細胞的60%～80%，分泌胰島素，胰島素可以降低血糖。②A細胞(α細胞)，約占胰島細胞的24%～40%，分泌胰升糖素，胰升糖素作用同胰島素相反，可增高血糖。③D細胞，約占胰島細胞總數的6%～15%，分泌生長激素抑制激素第十六頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素生物合成的控制基因在第11對染色體短臂上。在β細胞的細胞核中，第11對染色體短臂上胰島素基因區DNA向mRNA轉錄，mRNA從細胞核移向細胞漿的內質網，轉譯成由105個氨基酸殘基構成的前胰島素原。前胰島素原經過蛋白水解作用除其前肽，生成86個氨基酸組成的長肽鏈——胰島素原。胰島素原隨細胞漿中的微泡進入高爾基體，經蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三個精氨酸連接的鏈，斷鏈生成沒有作用的C肽，同時生成胰島素，分泌到β細胞外，進入血液循環中。未經過蛋白酶水解的胰島素原，一小部分隨著胰島素進入血液循環。第十七頁，共三十五頁，2022年，8月28日第十八頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素的分類動物胰島素：從豬和牛的胰腺中提取，兩者藥效相同，但與人胰島素相比，豬胰島素中有1個氨基酸不同，牛胰島素中有3個氨基酸不同，因而易產生抗體半合成人胰島素：將豬胰島素第30位丙氨酸，置換成與人胰島素相同的蘇氨酸，即為半合成人胰島素生物合成人胰島素：利用生物工程技術，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同第十九頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素基因的克隆表達鼠胰島素原cDNA連在pBR322上，轉化大腸桿菌進行克?。蝗说囊葝u素DNA將A肽和B肽的DNA片段分別于pBR322相連，通過對大腸桿菌轉化兒進行克隆；鼠胰島素使用PL啟動子，基因產物為融合蛋白，在β-內酰胺酶信號肽的作用下，穿過胞膜分泌到胞外。人胰島素使用β-半乳糖苷酶啟動子，表達融合蛋白β-半乳糖苷酶-A肽，β半乳糖苷酶-B肽，經溴化氫處理后，得A肽與B肽，通過雙硫鍵的結合，成為成熟的人胰島素分子。第二十頁，共三十五頁，2022年，8月28日α-淀粉酶基因工程α-淀粉酶普遍應用于食品、釀造、輕工業紡織、造紙、制藥等工業中。熱穩定α-淀粉酶已逐步取代中溫α-淀粉酶，并由微生物進行生產。通過基因工程的手段，將地衣芽孢桿菌的熱穩定α-淀粉酶基因轉移到枯草桿菌中，可以顯著提高產量。第二十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日第二十二頁，共三十五頁，2022年，8月28日第二十三頁，共三十五頁，2022年，8月28日第二十四頁，共三十五頁，2022年，8月28日第二十五頁，共三十五頁，2022年，